文献转载：粘连蛋白通过“摆动和夹紧”机制介导DNA环挤出过程

 

Benedikt W. Bauer, Iain F. Davidson, Daniel Canena, Gordana Wutz, Wen Tang, Gabriele Litos, Sabrina Horn
Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna BioCenter (VBC) Campus-Vienna-Biocenter 1, 1030 Vienna, Austria
Insitute for Biophysics, Johannes Kepler University Linz, Life Science Center, Gruberstrasse 40, 4020 Linz, Austria
Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna, A-1030 Vienna, Austria
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.016

摘要：

 

目前已经解析了大量的瞬时受体电位通道TRP(transient receptor potential)家族的结构，显示都是四聚体，但关于TRPV通道的许多方面仍然知之甚少，包括孔膨胀现象（pore-dilation phenomenon）。科学家通过超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM，在单分子水平上分析了膜嵌入的TRPV3，并发现了一种五聚体状态。

瞬时受体电位（TRP）通道是一个庞大的真核离子通道超家族，控制着多种生理功能，因此是极具吸引力的药物靶点。目前已确定了来自 20 多种不同 TRP 通道的 210 多种结构，且均为四聚体。尽管有如此丰富的结构信息，但关于 TRPV 通道的许多方面仍知之甚少，包括孔道扩张现象，即长时间激活会导致电导增加、对大离子的通透性增强以及整流性丧失。在此，我们利用日本RIBM公司的超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM，SS-NEX）在单分子水平上分析了嵌入膜的 TRPV3，并发现了一种五聚体状态。HS-AFM 动态成像显示，五聚体在与经典四聚体的动态平衡中具有短暂性和可逆性，通过膜扩散亚基交换实现。加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，五聚体的群体增加，DPBA 是一种已被证明可诱导 TRPV3 孔道扩张的激动剂。基于这些发现，我们设计了一条蛋白质生产和数据分析流程，最终获得了 TRPV3 的冷冻电子显微镜结构。五聚体，其孔径比四聚体大。进入和退出五聚体状态的缓慢动力学、加入 DPBA 后五聚体形成的增加以及孔径的扩大表明，五聚体代表了孔径扩张的结构相关性。因此，我们展示了膜扩散原体交换作为结构变化和构象变异性的一种额外机制。总的来说，我们为非典型的五聚体 TRP 通道组装提供了结构证据，为 TRP 通道研究开辟了新的方向。

 

简介：

环挤出假说认为，“染色体结构维持”（SMC）复合物通过将基因组 DNA 卷绕成环来形成染色体的顺式相互作用。这些相互作用具有重要功能，从细菌中复制 DNA 分子的局部分离到真核生物中长距离增强子 - 启动子接触的形成（参见 Davidson 和 Peters，2021 年综述）。在生化重组实验中获得了环挤出假说的直接证据。这些实验表明，凝聚素（一种在有丝分裂染色体中折叠 DNA 的真核 SMC 复合物）和粘连素（一种在间期介导染色质环化的相关复合物）能够以高达每秒 2.1 千碱基对的速度挤出 DNA，这一过程依赖于这些复合物的 DNA 刺激的 ATP 酶活性（Davidson 等人，2019 年；Ganji 等人，2018 年；Golfier 等人，2020 年；Kim 等人，2019 年）。

DNA 环挤出的机制尚不清楚，但已有很多推测。这些推测基于 SMC 复合物包含两个拉长的 SMC 子单元的二聚体这一观察结果，这些子单元可以采取不同的构象（参见 Yatskevich 等人，2019 年综述）。SMC 蛋白质最多可形成多达 12 种不同的构象，每种构象都具有不同的 DNA 结合和缠绕特性。这些构象的转换可能与环挤出机制有关。例如，有人提出 SMC 复合物可能通过交替采用“闭合”和“开放”构象来挤出 DNA，从而形成环。在“闭合”构象中，SMC 子单元的末端相互靠近，而在“开放”构象中，它们则相互远离。这种构象的交替可能使复合物能够捕获 DNA 并将其挤出形成环。然而，这些推测尚未得到实验证实，环挤出的确切机制仍不清楚。50 纳米长的卷曲螺旋。这些螺旋在一端有一个“铰链”，通过它两个 SMC 子单元二聚化，在另一端有 ATP 酶“头部”。这些头部与 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白的 ATP 酶结构域相关（Hopfner 等人，2000 年），并且能够相互作用形成两个复合的 ATP 结合位点。此外，ATP 酶头部通过一个 kleisin 子单元相连，从而形成三部分环状结构。通过电子显微镜（EM）和原子力显微镜（AFM），可以看到 SMC 复合物处于开放环构象（卷曲螺旋分离）、杆状构象（卷曲螺旋对齐）和弯曲构象（卷曲螺旋折叠且铰链靠近 ATP 酶头部）（综述见 Davidson 和 Peters，2021 年）。kleisin 子单元与另外一些子单元相关联，这些子单元对于环挤出是必需的，在粘连蛋白中称为 STAG1/STAG2 和 NIPBL（Davidson 等人，2019 年；Kim 等人，2019 年）。

“行走”和“毛毛虫模型”认为 SMC 复合物利用 ATP 酶头部之间的运动沿着 DNA“行走”，类似于细胞骨架运动蛋白的运动方式。沿着微管移动（Fudenberg 等人，2016 年；Nichols 和 Corces，2018 年）。‘泵送模型’提出，DNA 从铰链处向 kleisin 移动是通过卷曲螺旋的对齐以及 ATP 酶头部的分离进入相邻状态实现的（Diebold-Durand 等人，2017 年；Marko 等人，2019 年）。‘收缩模型’推测，卷曲螺旋在直和弯构象之间的交替移动 DNA（Ryu 等人，2020 年）。除了上述观察结果外，这些模型几乎没有实验支持，也没有一个经过严格的测试。因此，尚不清楚它们中哪一个（如果有的话）是正确的。
在这里，我们利用蛋白质工程和诱变技术结合单分子实验来分析人类粘连蛋白和 NIPBL 如何移动 DNA。我们的结果表明，环挤出依赖于粘连蛋白-NIPBL 上的五个 DNA 结合位点以及这些位点之间的三次大规模移动，这些移动部分相互耦合，并与 ATP 结合-水解循环耦合。我们提供了证据表明 SMC 亚基的上部卷曲螺旋自发对齐并弯曲。导致高亲和力 DNA 结合位点在铰链上向 SMC3 的 ATP 酶头部移动 50 纳米。在没有 ATP 的情况下，NIPBL 与铰链相互作用，但在有 ATP 的情况下，NIPBL 从铰链分离并将 DNA 夹在 SMC3 的头部。我们提出，环挤出取决于交替的 DNA 移位和夹紧步骤，分别由 50 纳米的铰链摆动和 NIPBL 与 SMC3 头部之间的相互作用介导。我们的数据进一步表明，NIPBL 只能参与铰链或 SMC3 头部的相互作用，而不能同时参与两者，这使得 ATP 依赖的夹紧步骤依赖于自发的铰链摆动，并为 DNA 挤出提供方向性。

 

 

 

结果：

（1）：人黏连蛋白由四个亚基组成：SMC1，SMC3，Scc1和STAG1。SMC1和SMC3通过它们的铰链结构域异二聚化。SMC1-SMC3铰链异二聚体与STAG1的“ U”的底部直接接触，DNA首先由NIPBL和STAG1募集到处于SMC1和SMC3头部结构域分离状态的黏连蛋白，ATP结合后，Scc1连接SMC1和SMC3的ATPase头部结构域形成环，并将DNA捕获在SMC隔室内。然后，NIPBL和STAG1包裹在DNA周围，形成中央通道并进一步包裹DNA。

 

 

（2）：通过TwoMP质量光度法（单分子质量光度计分析系统）证实了SMC1和SMC3头部结构域（SMC1HD、SMC3HD）可以各自结合单个DNA分子作为单体：在存在ATP的前提下，对SMC1HD和SMC3HD含和不含40碱基对（bp）双链（ds）DNA进行质量光度分析,负质量对应于蛋白质-DNA复合物在两帧之间从表面解离的事件。

 

 

（3）：冷冻电镜Cryo-EM在不同的构象中观察到了黏连蛋白，但尚不清楚哪些在天然条件下存在，以及黏连蛋白如何从一种构象变化到另一种构象。因此，作者通过超高速视频级原子力显微镜HS-AFM实时成像黏连蛋白。为了确定哪些亚基和结构域可以通过HS-AFM可视化，作者分析了在含有SMC1、SMC3和SCC1的三聚体及结合到NIPBL（N）的三聚体，以及含有SMC1、SMC3和SCC1和STAG1（S）的四聚体及结合到NIPBL的四聚体，图F中显示了对应于铰链（hi）、头部（he）、NIPBL（N）和STAG1（S）的密度。

 

 

（4）：在上述通过超高速视频级原子力显微镜HS-AFM实时成像黏连蛋白，发现SCC1无法清晰可见，但通过质量光度法测定的二聚体（SMC1、SMC3）和三聚体（SMC1、SMC3和SCC1）的质量分布可以证实这些复合体中含有SCC1，并且二聚体（286 kDa）和三聚体（399 kDa）的理论质量与测量值非常一致（图G、H）。质量光度法（Mass Photometry）是一种革命性的分子分析新方法。它能够准确测量溶液中天然状态下的单个分子的质量数，无需标记，为生物分析和生物分子功能研究开辟了新的途径。其原理是：粒子散射的光信号与粒子的体积和折射率成线性关系。由于生物分子的光学性质和密度仅有百分之几的差别，所以散射信号也就与分子的质量成正比，因此可以用光称量单个分子。散射信号与质量的相关性适用于各种生物分子（例如糖蛋白、核酸和/或脂质），这使得质量光度法成为溶液中生物分子的通用分析工具。

 

 

 

（5）：在ATP存在下，（SMC1、SMC3和SCC1）三聚体复合物方式上在环状（rings）、棒状（rods）和扭曲（bent）构象之间交替出现（图I）。在环形复合体中，卷曲的线圈被拉伸但彼此分开，而头部结构域要么相互接触，代表ATP接合状态；要么头部结构域脱离，代表ATP非接合状态。在杆状复合体中，头部结构域脱离，线圈对齐；在许多情况下，相互扭曲（图I），在这种状态下，铰链有时会短暂打开。

 

 

（6）：（SMC1、SMC3和SCC1）三聚体复合物在接合和脱离状态之间振荡，在后一种构造中，可以对齐和弯曲其线圈（图K，head movement，coil alignment）；当STAG1和NIPBL与三聚体结合时，也观察到类似的变化；当线圈折叠成弯曲是不对称状态时，铰链靠近一个头部，但不靠近另一个头部（图K，hinge bending，铰链弯曲）。

 

讨论：

DNA 转运的摆动与夹持模型

尽管人们认为由 SMC 复合物通过环挤出折叠 DNA 的过程具有重要的结构和调节功能，并且决定了所有生命王国中的基因组结构（综述见 Davidson 和 Peters，2021；Yatskevich 等人，2019），但其具体机制仍是个谜。因此，我们从单分子水平上分析了人类粘连蛋白-NIPBL 如何介导环挤出。

基于这些实验结果，我们提出 DNA 是通过粘连蛋白的铰链向 SMC3 的 ATP 酶头部摆动而转运的，并在那里由铰链向 ATP 酶头部传递，这一过程受 NIPBL 控制（图 7F）。根据这一假设，粘连蛋白-NIPBL 会在无核苷酸的空载状态下在铰链处结合 DNA，在这种情况下，铰链与 NIPBL 的鼻部相互作用。粘连蛋白的卷曲螺旋会自发对齐并折叠，这一过程由热运动驱动，从而将结合在铰链上的 DNA 片段向 SMC3 头部移动约 50 纳米。我们将这一步称为“铰链摆动”。如果在这种构象下 ATP 结合到 ATP 酶头部，这将导致会导致 NIPBL 的鼻部与铰链分离，并使 DNA 片段从铰链转移到 SMC3 头部，此时 NIPBL 的主体部分会将其夹住。随后 ATP 酶头部的结合会使铰链与 SMC3 头部分离，因为卷曲螺旋的弯曲与头部结合是不相容的。由于此时 DNA 已被 NIPBL 夹在 ATP 酶头部，铰链无法将 DNA 移回，只能与其分离，这一过程可能因 NIPBL 的鼻部与铰链分离而得到促进。在此过程中铰链的大幅度自由移动可能使其能够寻找下一个 DNA 片段。由头部结合和 DNA 处于夹具内所引发的 ATP 水解会通过导致头部脱离和夹具解体而重新形成无载状态。这些事件会使铰链能够再次与 NIPBL 的鼻部相互作用，进行下一轮 DNA 转运，并使夹在 ATP 酶头部的 DNA 解夹，以便在下一次铰链摆动时将其推过它们。

该模型优雅地解释了 DNA 转运如何能够实现。与头部结合和 ATP 酶循环同步：由于 NIPBL 在无核苷酸状态下与铰链相关联，ATP 结合可能仅在螺旋线圈自发弯曲使铰链 - NIPBL 接口靠近 SMC3 头部时才会诱导头部结合和/或 ATP 水解，这样 NIPBL 就能将 DNA 夹在 SMC3 头部上，而夹具内的 DNA - NIPBL 接触（与 DNA - SMC3 头部接触一起）可以触发 ATP 水解。如果不存在这样的耦合机制，头部结合可能会在任何时候发生，甚至在螺旋线圈伸展时，这会导致没有 DNA 移动的非生产性结合 - ATP 水解循环。由于粘连素 - NIPBL 能够以高达每秒 2.1 千碱基对的速度挤出 DNA（Davidson 等人，2019 年；Golfier 等人，2020 年；Kim 等人，2019 年），我们怀疑这种非生产性的头部结合事件很少发生。因此，NIPBL 能够以互斥的方式与铰链和 SMC3 头部相互作用，并通过这种方式从一个 DNA 结合位点“跳船”到另一个位点，可能是 DNA 移动过程中的关键要素。重要的是，该模型还能解释在核小体或其他结合 DNA 的蛋白质存在的情况下，黏连蛋白如何能够移动 DNA（Pradhan 等人，2021 年）。因为当 ATP 酶头部脱离时，染色质纤维会被移动到 ATP 酶头部之外，彼此相距 30 至 50 纳米，所以会有空间让结合 DNA 的蛋白质从 ATP 酶头部旁通过。

也有可能 DNA 是向相反方向移动的（即从 ATP 酶头部向铰链方向移动），这是基于建模和 STAG1 与铰链一起移动的推测提出的（Higashi 等人，2021 年）。请注意，我们的单分子荧光共振能量转移实验未能检测到铰链与 STAG1 之间的稳定相互作用，因此不支持这一推测（图 S7E - S7G）。基于我们的观察，即铰链只能在 SMC3 头部与 SMC1 头部脱离时靠近 SMC3 头部，我们认为这种可能性较小。因此，如果铰链要从 ATP 酶头部获取 DNA，这些头部首先必须脱离，这可能导致 DNA 在铰链靠近头部并能够结合 DNA 之前就从头部解离。因此，在此阶段，DNA 可能既未与头部结合，也未与铰链结合，而必须由其他位点固定位置并保持正确的方向。尽管这种情况有可能发生，但我们认为其不太合理。

总之，我们的研究结果首次揭示了人类黏连蛋白-NIPBL 复合物通过何种机制原理移动 DNA 以介导 DNA 环挤出，并且可能对理解其他 SMC 复合物如何执行此功能具有更广泛的意义。

本研究的局限性

尽管对于环挤出过程来说至关重要，但我们目前仍无法确定 STAG1 在此过程中的分子功能。由于技术原因，此处所述的构象变化目前仅能通过高分辨率原子力显微镜（HS-AFM）观察到三聚体和四聚体的黏连素复合物在无 DNA 存在时的情况，而无法观察到在 DNA 上进行活性环挤出的黏连素-NIPBL 分子的情况。荧光共振能量转移（FRET）只能测量标记蛋白质结构域之间在 10 纳米范围内的接近程度，但无法确定在构象变化过程中这些结构域分离的距离。这些变化如何使 DNA 移动是通过多种结果的结合推断出来的，包括确定环挤出所需的 DNA 结合位点、这些位点在构象变化期间的移动情况以及这些移动的调节和相互依赖性，但 DNA 的移动尚未直接测量或可视化。要实现这些目标并解决 DNA 移动如何导致环挤出的问题，还需要进一步的研究。

 

方法：

详细方法见本论文的在线版本，包括以下内容：

关键资源表

资源可用性

材料可用性

数据和代码可用性

实验模型和受试者详情

分子克隆和诱变

从 SF9 昆虫细胞培养物中表达和纯化蛋白质

从大肠杆菌细胞培养物中表达和纯化蛋白质

从 HeLa 细胞培养物中表达和纯化蛋白质

HeLa 粘连蛋白构建体的纯化

方法详情

琥珀抑制和紫外线诱导的蛋白质 - DNA 交联

电泳迁移率变动分析（EMSAs）

质量光度法

单分子质量光度计，是基于质量光度学研发的一款设备，建立在干涉反射显微镜和干涉散射显微镜的原理之上。牛津大学的Kukura教授团队证明了单分子在观察界面上散射的微小光量能够被可靠地检测到，可以用于计算溶液中的分子数量，更重要的是，它与分子质量直接相关，可以用于测量分子的质量。

样品底部照射激光束并预先聚焦载玻片的上表面，您将观察到来自载玻片的反射光。如果样品（蛋白质分子等）与载玻片接触，则折射率只会在该部分发生局部变化，并且来自被测物体的散射光也会被检测到。附着在载玻片上的分子散射的光干扰了该界面反射的光。样品在载玻片上散射光能够被检测到，干涉对比度与质量成线性关系。所以质量光度法可以用于计算溶液中的分子数量，更重要的是，它与分子质量直接相关，可以用于测量分子的质量。

单分子质量光度计算可以精确测量溶液中单个分子的质量——处于原始状态、无需标记，提供了一种新的分析生物分子的方法，能够以超高的灵敏度、速度、准确度和简单性来表征你感兴趣的分子，是监测蛋白质纯化、优化样品、研究蛋白质功能和相互作用的理想仪器。

ATP 酶活性测定

偶联 ATP 酶活性测定

环挤出实验

环维持实验

超高速原子力显微镜

超高速视频级原子力显微镜（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大学 Prof. Ando 教授团队研发，日本RIBM公司（生体分子计测研究所株式会 社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商业化的产品，可以达到视频级成像的商业化原子力显微镜。HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。超高速视频级原子力显微镜HS-AFM主要有两种型号，SS-NEX样品扫描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探针扫描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有150多位用户，发表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等顶级杂志。

相较于目前市场上的原子力显微镜成像设备，HS-AFM突破了 “扫描成像速慢”的限制，扫描速度高可达 20 frame/s，并且有 4 种扫描台可供选择。样品无需特殊固定染色，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。液体环境下直接检测，超快速动态成像，分辨率为纳米水平。探针小，适用于生物样品；悬臂探针共振频率高，弹簧系数小，避免了对生物样品等的损伤。悬臂探针可自动漂移校准，适用于长时间观测。采用动态PID控制，高速扫描时仍可获得清晰的图像。XY轴分辨率2nm；Z轴分辨率0.5nm。

HS-AFM不仅拥有超高扫描速率与原子级别分辨率，而且具有操作的简易性，使得对单分子动态过程的捕捉变得十分方便，为科研工作者研究和理解生物物理、生物化学、分子生物学、病毒学以及生物医学等领域的单分子动态过程提供了一款强大的工具。

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用于 smFRET 实验的蛋白质标记

单分子 FRET

旋转阴影电子显微镜

荧光偏振测定

TNP-ATP 结合测定

定量和统计分析

环挤出实验分析

高速原子力显微镜数据分析

smFRET 数据分析

 

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.016

这项工作的完成主要借助了日本RIBM公司研发的超高速视频原子力显微镜HS-AFM，HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够实现在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。待测样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。推出至今，全球已有150多位用户，发表SCI论文300余篇，其中包括Science, Nature, Cell 等顶级杂志。 

小结：使用HS-AFM获得的高空间&时间分辨率的视频图像，可以准确地反应生物大分子的运动状态，用于定量研究。

 

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类器官串联芯片培养系统—HUMIMIC；类器官灌流式培养和代谢监测系统—IMOLA；

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