文献转载：粘连蛋白通过“摆动和夹紧”机制介导DNA环挤出过程

Shifra Lansky, John Michael Betancourt, Jingying Zhang, Yining Jiang, Elizabeth D. Kim

A pentameric TRPV3 channel with a dilated pore

206 | Nature | Vol 621 | 7 September 2023

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06470-1

美国纽约威尔·康奈尔医学中心、圣路易斯华盛顿大学医学院等的科学家研究通过超高速视频原子力显微镜HS-AFM进行单分子成像，首次发现TRPV3通道在膜环境中可形成五聚体构象，且孔道处于扩张状态。五聚体与传统四聚体通过膜扩散性单体交换动态平衡，二苯基硼酸（DPB，TRPV3通道激动剂）可促进五聚体形成，导致孔道扩张。五聚体构象的缓慢动力学特征及扩张孔道表明其与孔道扩张直接相关，为非典型五聚体TRP通道结构提供了结构证据，揭示了膜扩散性单体交换是结构变化和构象多样性的额外机制。随后通过差示扫描荧光法（nanoDSF）实验进一步探究了DPBA 对 TRPV3 四聚体状态的破坏作用。相关数据发表在《Nature》论文《A pentameric TRPV3 channel with a dilated pore》。

瞬时受体电位（TRP）通道是一个庞大的真核离子通道超家族，控制着多种生理功能，因此是极具吸引力的药物靶点。目前已确定了来自 20 多种不同 TRP 通道的 210 多种结构，且均为四聚体。尽管有如此丰富的结构信息，但关于 TRPV 通道的许多方面仍知之甚少，包括孔道扩张现象，即长时间激活会导致电导增加、对大离子的通透性增强以及整流性丧失。在此，我们利用日本RIBM公司的超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM，SS-NEX）在单分子水平上分析了嵌入膜的 TRPV3，并发现了一种五聚体状态。HS-AFM 动态成像显示，五聚体在与经典四聚体的动态平衡中具有短暂性和可逆性，通过膜扩散亚基交换实现。加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，五聚体的群体增加，DPBA 是一种已被证明可诱导 TRPV3 孔道扩张的激动剂。基于这些发现，我们设计了一条蛋白质生产和数据分析流程，最终获得了 TRPV3 的冷冻电子显微镜结构。五聚体，其孔径比四聚体大。进入和退出五聚体状态的缓慢动力学、加入 DPBA 后五聚体形成的增加以及孔径的扩大表明，五聚体代表了孔径扩张的结构相关性。因此，我们展示了膜扩散原体交换作为结构变化和构象变异性的一种额外机制。总的来说，我们为非典型的五聚体 TRP 通道组装提供了结构证据，为 TRP 通道研究开辟了新的方向。

瞬时受体电位（TRP）通道构成一个庞大的离子通道超家族，广泛表达于脊椎动物、无脊椎动物、酵母和藻类等真核生物中。该类通道可响应多种刺激类型，并参与多样化的生物过程，包括温度感知、伤害性感受和味觉感知等感觉功能，以及体液分泌、离子稳态、溶酶体功能、免疫细胞功能、心脏与平滑肌功能。由于其广泛的表达分布和生理功能，TRP通道的突变会导致多种疾病，如疼痛、特应性皮炎、哮喘、心脏疾病及神经与代谢紊乱。在TRP通道结构与功能研究领域取得的重要进展，始于通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）首次解析的TRPV1通道结构。这一突破标志着冷冻电镜分辨率革命中膜蛋白结构解析的开端。截至目前，已有超过20种不同TRP通道的210余个结构被解析，所有结构均呈现四聚体组装模式。

TRPV家族以香草素配体结合位点命名，由TRPV1-6六个蛋白组成。其中TRPV1-4属于温度激活型TRP通道（thermo-TRPs），而TRPV5-6则是参与钙离子吸收的钙选择性通道。值得注意的是，TRPV1-4不仅能被热激活，还可被多种天然及合成配体激活（例如：TRPV1（辣椒素）、TRPV2（大麻二酚）、TRPV3（香芹酚、樟脑、百里香酚）以及TRPV4（花生四烯酸乙醇胺、花生四烯酸））。迄今已解析超过130个TRPV结构，涵盖配体存在/缺失状态及多种构象状态，每个家族成员均有多个代表性结构。所有TRPV通道结构相似，主要包含巨大的细胞内锚蛋白重复结构域（ARD）和由六个螺旋（S1-S6）组成的跨膜结构域（TMD）。其中S1-S4螺旋形成电压传感器样结构域（VSLD），而S5-S6螺旋构成孔道结构域（PD）。TRPV通道还包含一个由连接结构域、pre-S1螺旋和C末端结构域（CTD）组成的耦合结构域，SF以及位于脂质双层与细胞质交界处的保守的 TRP 螺旋（图 1a、b）8,16。这些结构域以所谓的结构域交换式排列，使得四聚体中一个亚基的 S1-S4 螺旋与相邻亚基的 S5-S6 螺旋相互作用（图 1c）。

然而，尽管 TRPV 通道的结构信息丰富，但其门控周期的许多细节仍不清楚且存在争议，例如，热触发激活的机制、功能周期中各状态（包括敏化和脱敏状态）的结构关联以及 TRPV 通道中众多配体结合位点在配体激活机制中的作用。另一个结构上存在争议的问题涉及孔道扩张现象。这一现象在功能上已被报道存在于 TRPV1、TRPV3、TRPA1以及 TRPV2 的一个突变体28 中，即长时间的热和/或激动剂激活会导致电导显著增加、离子选择性丧失以及对大阳离子（如 N-甲基-D-葡糖胺（NMDG+）、三羟甲基氨基甲烷）的通透性增加。三甲胺（Tris+）和 2-（甲基氨基）乙醇（2-MAE+）的通透性增加以及整流作用的丧失表明通道孔径随时间逐渐扩大。尽管典型的激活动力学很快，在毫秒范围内，但孔径的扩大则发生在秒至分钟的时间尺度上。其发生的缓慢性表明，它与典型的开放状态之间存在较大的能量障碍。因此，孔径扩大的状态在结构上与典型的激活状态有显著差异，孔径明显增大，而且在动力学上，其形成的时间尺度对于典型的蛋白质构象变化来说异常长。

为了解决其中一些未解决的问题，我们在此使用超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM）直接在缓冲溶液中、在生理温度和压力下以约 1 秒的时序分辨率对膜嵌入的全长人 TRPV3 进行单分子水平的成像。我们认为，要深入了解一些遗留问题，采用一种迄今未用于分析 TRP 通道且具有质的不同能力的新技术可能会有所帮助。我们证明了 TRPV3 通道能够形成一种此前未曾观察到的五聚体状态，这种五聚体状态较为罕见、可逆且短暂：五聚体状态与四聚体状态在数秒至数分钟的时间尺度上通过膜扩散交换亚基而相互转换。我们进一步证明，在加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，这种五聚体状态的出现频率增加了一倍，DPBA 是一种合成激动剂，已被证明能增强 TRPV3 电流并导致孔径扩张。基于对这种非典型状态及其形成方式的了解，我们调整了蛋白质生产和分析流程，从而能够以 4.4 埃的分辨率确定 TRPV3 五聚体的冷冻电镜结构，揭示出一个宽大的通道孔，比四聚体中的孔大得多。总体而言，我们的研究结果表明，TRPV3 通道能够形成五聚体状态，这可能是功能上孔径扩张状态的结构对应物，并可能为 TRP 通道研究开辟新的途径。

图 1 | TRPV3 的膜重组。a，TRPV3 单体结构，包括 ARD（紫色）、连接区和前 S1（蓝色）、VSLD（S1–S4，黄色）、PD（S5–SF–S6，粉–绿–粉）、TRP 螺旋（米色）和 CTD（蓝色）。b，序列表示，颜色编码如 a 所示。c，人类 TRPV3 四聚体结构（PDB 6UW4）的细胞内（上）和侧面（下）视图，四个亚基颜色编码。VSLD 相对于 PD 发生了结构交换，例如，紫色亚基的 VSLD 与黄色亚基的 PD 相互作用。d，TRPV3 在酵母极性脂质和 POPC:DOPS：胆固醇（8：1：1，质量比）膜中重组的代表性负染 EM 图像。类似的重组和 EM 图像已重复超过 20 次。比例尺，50 纳米。e，TRPV3 重组的 HS-AFM 视频帧概览。f，e 中虚线轮廓的高度分布分析（左上），根据高度伪彩色标尺着色。g，e 中虚线的横截面分析（右下）。

图 2 | TRPV3 五聚体与经典的 TRPV3 四聚体在膜中共存。a，中分辨率 HS-AFM 视频帧（补充视频 5 - 9）显示膜中的 TRPV3 存在多个具有五聚体寡聚态的通道（箭头所示）。比例尺，15 纳米。b，高分辨率 HS-AFM 视频帧（补充数据视频）显示四聚体和五聚体 TRPV3 通道。比例尺，5 纳米。c，TRPV3 四聚体（绿色）和五聚体（紫色）单分子的径向轮廓（ b）。黑色线分别代表具有 90°和 72°峰周期性的正弦拟合。d，四聚体（绿色）和五聚体（紫色）相关平均值的高度轮廓（来自 b，第二面板），分别沿插图中的绿色和紫色线。e，突起高度分析。TRPV3 四聚体（中间，绿色）和五聚体（右侧，紫色）相对于脂质双层的高度分布直方图。左面板显示了从四聚体、五聚体和脂质双层区域（直径 8.5 纳米）提取高度值的虚线轮廓，从 100，734 个像素（206 帧中的 489 个像素）中提取。FWHM，半峰全宽。

 图 3 | TRPV3 四聚体 - 五聚体和五聚体 - 四聚体的转换，以及四聚体和五聚体状态之间完全可逆性的观察。a、b，TRPV3 四聚体 - 五聚体转换的示例。c、d，TRPV3 五聚体 - 四聚体转换的示例。e，TRPV3 四聚体 - 五聚体 - 四聚体转换。f，TRPV3 五聚体 - 四聚体 - 五聚体转换。白色箭头分别指示单体“攻击”并插入四聚体以及从五聚体中解离。g，观察到的转换的数量和类型（灰色区域表示观察窗口）。从上到下：开放式的五聚体状态观察、无始无终的五聚体观察、观察到的五聚体向四聚体的转换以及包含五聚体状态的起始和结束，即完整的四聚体 - 五聚体 - 四聚体转换。h，观察到的五聚体状态向四聚体转换的停留时间（n = 17）。直方图拟合为指数衰减，τ = 192 秒，调整后的 R² = 0.77。i，无始无终的五聚体状态的停留时间（n = 65）。平均停留时间 τ = 172 秒。

为了进一步探究 DPBA 对 TRPV3 四聚体状态的破坏作用，我们进行了纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）实验，并通过监测 350 和/或 330 纳米处荧光发射随温度的变化来测量 TRPV3 的热稳定性。在 nanoDSF 实验中，测量的是蛋白质中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的固有荧光，其会因局部环境的变化而改变，例如温度依赖性的构象变化、寡聚体解离和/或变性。TRPV3 的热变性曲线显示出两个一阶导数峰，分别对应两个熔解温度，第一个熔解温度（Tm1）表现为反向蓝移曲线，在 55.5 ± 0.1°C 处有一个拐点，第二个熔解温度（Tm2）在 63.4 ± 0.3°C 处有一个拐点（图 4c，d）。值得注意的是，当向同一蛋白质样品中加入 320 μM DPBA 时，Tm1 降至 52.7 ± 0.6°C，Tm2 降至 61.3 ± 0.5°C。而当分别加入 32 和 100 μM DPBA 时，这些配体浓度已被证明可诱导典型的尽管激活了电流但并未增强次级电流 25，熔点更接近于无配体状态，即 Tm1 和 Tm2 分别为 55.1 ± 0.5 和 54.5 ± 0.3 摄氏度以及 63.1 ± 0.3 和 62.6 ± 0.6 摄氏度（图 4c，d）。最后，当向样本中加入 1000 μM 的 DPBA（一种已被证实会导致导电性崩溃的配体）时，观察到稳定性进一步显著下降，Tm1 和 Tm2 分别为 51.3 ± 1.0 和 60.5 ±0.3°（图 4c、d）。在 350 纳米和 330 纳米处的荧光红移表明内部色氨酸暴露，而荧光蓝移则内部色氨酸缺失或在热变性过程中内部酪氨酸的暴露相关。通过检查 TRPV3 结构中酪氨酸和色氨酸的分布，我们发现许多内部隐藏的色氨酸和酪氨酸，特别是许多隐藏在亚基界面处的酪氨酸（补充图 4）。这使我们推测 Tm1 对应于 TRPV3 低聚物的解体，表现为亚基界面处的酪氨酸暴露，而 Tm2 对应于 TRPV3 单体的变性。另一种解释可能是 Tm1 与温度感应构象变化有关，而 Tm2 与单体断裂和变性有关。无论具体事件的顺序如何，DPBA 显然影响了单体界面的完整性并使通道不稳定。因此，这些结果与我们在添加 DPBA 后通过 HS-AFM 观察到的四聚体减少和 TRPV3 片段增加是一致的。

图 4 | DPBA 导致 TRPV3 五聚体增加。a，存在 320 μM DPBA 时膜嵌入 TRPV3 的 HS-AFM 视频帧。在许多四聚体中，观察到了 TRPV3 五聚体（白色箭头）和片段（灰色箭头；1，单体；2，二聚体；3，三聚体）。比例尺，15 纳米。b，无（深棕色）和存在 320 μM DPBA（浅棕色）时四聚体和五聚体种群（左）以及四聚体、五聚体和片段种群（右）的统计。数据以 n = 3 个生物独立样本（圆圈）得出的种群百分比的平均值 ± 标准误差表示。统计学显著性通过单尾双比例 Z 检验进行评估，在所有情况下绝对 Z 值均大于 4.9，对应 P < 0.0001。c，d，无（深棕色）和存在 32 μM（n = 6 个生物独立实验）、100 μM（n = 6）、320 μM（n = 7）时 TRPV3 的热变性曲线（原始数据（上）和一阶导数（下；方块表示 f’ = 0（为清晰起见，曲线垂直偏移）Tm1（向下箭头）和 Tm2（向上箭头）并且 1000 μM 的 DPBA（n = 6），用逐渐变浅的棕色表示，表明（c）在添加 320 和 1000 μM 的 DPBA 后（d），Tm1 和 Tm2 显著降低。Tm 值以 n = 6 或 7 次独立生物学实验所得结果的平均值 ± 标准误表示（圆圈）。统计学显著性通过单侧 Welch t 检验进行评估，结果表明添加 320 μM 的 DPBA 后，Tm1 和 Tm2 均显著降低（99%置信水平，P = 0.000038 和 0.0019），而添加 1000 μM 的 DPBA 后，Tm1 和 Tm2 进一步显著降低（95%置信水平 P = 0.015 和 99%置信水平 P = 0.0043）。**P < 0.025；***P < 0.005。 

方法：
HS-AFM

将 2 微升的 TRPV3 重组囊泡液滴置于 1.5 平方毫米的新鲜云母表面，该表面用紫外线胶粘在石英样品台上。在湿度室中孵育 5 分钟后，用成像缓冲液（无配体（apo）条件：20 毫摩尔 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩尔 NaCl；孔扩张条件：20 毫摩尔 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩尔 NaCl 和 320 微摩尔 DPBA）轻轻冲洗样品台上的样品，然后将其安装在 HS-AFM 液体池中。在 150 毫摩尔 NaCl 存在的情况下，一个薄薄的缓冲液层（约 5 埃）将支撑膜与云母基底隔开，使膜蛋白能够扩散，如本文中 TRPV3 通道在密集膜中的横向和旋转运动所显示的那样。在室温下使用 HS-AFM（SS-NEX，日本RIBM公司）以振幅调制模式拍摄图像，该模式具有优化的扫描和反馈参数，并使用 IgorPro RIBM 软件（Ibis v.1.1.0，IgorPro v.6.3.7.2）。使用了标称弹簧常数为 0.15 牛顿/米、共振频率约为 650 千赫兹、在缓冲液中的品质因数约为 1.5 的超短（8 微米）悬臂（USC-F1.2-k0.15，NanoWorld）。IgorPro v.8（WaveMetrics）用于高扫描速率原子力显微镜（HS-AFM）数据采集。采用氧等离子体蚀刻来锐化针尖。HS-AFM 图像以每秒 0.5 至 3 帧的速度采集，像素采样率为每像素 1.25 至 8 埃。在非常相似的条件下进行的 HS-AFM 成像已用于分析其他几种膜蛋白的结构和动态，如 OmpG、AqpZ、ec-CLC、GltPh、CorA、Piezo-1 和 GLIC42，51–57，但从未观察到像此处记录的 TRPV3 这样的寡聚化变化。HS-AFM 视频对齐、平整化和横截面分析、高度分布和径向轮廓分析均在 ImageJ 中完成。

NanoDSF

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。该方法具有蛋白样品消耗量少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。

使用 NanoDSF 技术对在 HEK293S GnTI− 细胞中表达的纯化 TRPV3 进行了热变性曲线测量，所用样品为从尺寸排阻色谱柱中获得的对应纯四聚体的峰组分，将其稀释至 3.3 μM 浓度（在 20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM βME 和 0.01%（w/v）GDN 中）。在无配体条件下以及分别加入 32（n = 6 次生物独立实验）、100（n = 6）、320（n = 7）和 1，000 μM（n = 6）DPBA 后进行了测量，使用 Tycho NT.6仪器，按照制造商的说明进行操作。采用单侧不等方差（Welch）t 检验评估统计学意义，结果表明加入 320 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 均显著降低（99%置信水平，P = 0.000038 和 0.00190），而加入 1，000 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 进一步降低（P = 0.015（95%置信水平）和 0.0043（99%置信水平）。

新品推荐——日本RIBM公司研发的超高速视频原子力显微镜HS-AFM来到中国

为了更好地服务国内客户，北京佰司特科技有限责任公司将这款超高速视频级原子力显微镜引进中国，如果您有科研上的需要，欢迎致电联系我们！

北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司，郑州大学河南省医药科学研究院，吉林大学，辽宁大学，中国科学院成都生物研究所，北京工商大学，石河子大学，友谊医院消化健康全国重点实验室，深圳技术大学，中国科学院深圳先进技术研究院、清华大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano等）。

联系我们

北京佰司特科技有限责任公司 

网址：www.best-sciences.com

电话：010-68999936

邮箱：best_science@163.com

地址：北京市朝阳区东三环中路乐成中心B座2109单元

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)

类器官串联芯片培养系统—HUMIMIC；类器官灌流式培养和代谢监测系统—IMOLA；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子稳定性分析仪（磁镊力谱测量仪）—HiMT；单分子质量光度计—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

微纳加工点印仪—NLP2000/DPN5000；台式原子力显微镜—ACST-AFM；全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；