应用案例：iPSC分化的四器官串联共培养

Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip

Future Sci. OA (2019) 5(8), FSO413

微观生理学系统在推动全球药物开发模式转变方面发挥着举足轻重的作用。在这里，我们设计了一个四器官芯片 (HUMIMIC Chip4, TissUse GmbH, Berlin, Germany)，将微型化的人体肠道、肝脏、大脑和肾脏模型相互连接在一起。四个器官模型均由来自同一健康供体的诱导多能干细胞预先分化而成，并整合到微生理系统中。四种自体类器官模型在不含组织特异性生长因子的共同培养基中共培养 14 天后获得成功。虽然共培养培养基中没有添加生长因子，但肠道、肝脏和神经元的类器官模型都保持了特异性的Marker表达。只有肾脏类器官被共存细胞过度生长影响，没有进一步分化。这一模型平台将为自体共培养交流试验、疾病诱导和后续药物测试铺平道路。

内容提要：

肠、肝、脑、肾四个人体器官的模型是在一个微型生物系统（称为微生理系统，MPS）中培养的。器官模型被放置在生物反应器的不同小室中，这些小室间通过微流道连接。这种流体循环使四个器官模型之间能够相互交流，类似于人体器官之间的血液循环。这些器官模型由来自单一捐献者的诱导多能干细胞设计而成。因此，所有器官模型都具有相同的遗传背景。这可能有助于将来对药物进行更准确、更针对病人的测试。

过去十年间，微生理系统（MPS）在复杂性方面有了长足的发展。它们与生理学的相关性增强了检测结果与人体情况的可转化性。各种模拟活体组织结构和生理流动条件的系统已被证明在药物开发过程的各个阶段都极具价值。迄今为止，在 MPS 中主要使用来自不同供体的细胞系或原始组织进行共培养。然而，在选择复杂的多器官系统甚至最终整合免疫分子时，共培养过程中不同组织的遗传背景是一个主要问题。因此，需要从一个自体来源的组织中建立MPS。从单一诱导多能干细胞（iPSC）来源进行器官分化可为这一挑战提供解决方案。利用健康供体的iPSC衍生的器官组织重现治疗效果的模型，以及利用患病供体的iPSC衍生的器官组织或通过对健康 iPSC 进行基因组编辑生成定制的疾病模型，都显示出巨大的应用前景。MPS能以生物可接受的最小尺度在体外模拟人类生物学。通过控制动态液体流动，可在尽量少用人体细胞和组织的情况下模拟器官功能，为组织提供生理营养和氧气供应。此外，多器官MPS 还能模拟复杂的生物过程，包括器官与器官之间的相互作用、系统稳态和药代动力学。这些系统将使药物测试更快、更准确、更具成本效益和临床相关性。近年来，出现了许多基于干细胞的细胞分化方法。此外，一些结合干细胞和 MPS 的研究也已发表。突出的例子包括：在芯片上将iPSCs功能性分化为心肌细胞或肝细胞样细胞；在可灌流器官芯片系统中分化和培养三维（3D）脑器官；以及在微流体设备中培养和分化间充质干细胞。然而，据我们所知，目前还没有一种多器官 MPS 在共用培养基微流道中培养完全由 iPSC 衍生的类器官。传统的 iPSC 衍生培养需要高度专业化的培养条件。例如，每种细胞类型都需要一套经过调整的生长因子。因此，使用常规培养方法无法直接培养出多个类器官培养物。为了解决这个问题，我们调整了最近发表的微生理多器官芯片（MOC）平台，以培养所需的类器官。此前已有研究表明，MOC 可在平衡状态下对基于细胞系或原代细胞的各种来源的组织模型进行长达 28 天的共培养。我们认为，即使不添加组织特异性生长因子，iPSC 来源的肠道、肝脏、大脑和肾脏的预分化器官模型也能在微流道的培养条件下同样保持其表型。在这里，我们描述了在四器官芯片中对来自单一供体的四个iPSC衍生类器官培养物进行共培养的情况。肠道、肝脏和神经元在缺乏生长因子的普通培养基中共培养的 14 天中，这些模型都保持了各自的表型。只有肾脏模型，没有进一步分化。

结果

四器官芯片的设计目的是以模拟体内情况的排列方式承载肠、肝、肾和神经球的培养空间（图 1A）。选择这样的器官组合是为了研究评估化合物的 ADME（吸收、分布、代谢和排泄，absorption, distribution, metabolism, excretion）情况。神经元组织被列为第四个效应器官。通道、细胞培养室和流动特性的尺寸数据建立模型，以反映它们之间的生理关系。

以前的研究表明，施加剪切应力可促进肾细胞的分化和功能。为肾细胞培养建立了单独的流路，以便在肾小管两侧调节剪切率。因此，该布局包括两个微流道（称为 “血液流路”和 “排泄流路”），这两个流路在肾区重叠，并由经过处理的细胞培养多孔聚碳酸酯膜隔开（图 1A）。每个流路中都有一个培养基储槽，可对上清液进行取样。培养基由两个内置气动微流泵通过微流体管路进行灌流，每个流路一个灌流管道。微流泵技术基于 TissUse 最初的 MOC 平台。其长期稳定性和对各种流速的可调节性此前已得到验证。

为了从体外到体内进行定量推断，我们采用了一种平行的、受生理学启发的血流流经隔室的方案，以及一种模拟生理血流比例的培养基分区（图 1B）。因此，血路通道的尺寸是根据人体生理比例确定的。相关数据来自 1000 名 40-60 岁的模拟欧洲男性，由Certara/SimCyp公司提供。四个目标器官的平均值见。根据这些数值，各器官从主通道获得的血流比例各不相同（图 1C）。使用 MATLAB（Mathworks）和 COMSOL Multiphysics 5.2a 对通道的流动阻力进行了建模。因此，液流被简化为层流和稳定流。静液压力和两个流路的相互作用被忽略。

器官分区的比例是根据各器官最小功能单位的数量确定的。10 个肝小叶相当于 1 × 10⁶ 细胞被放置在一个 14.7 μl 的小室中。将这一缩减比例同样应用到肠道和神经元中，可得到 12-24 mm² 和 4-6 mm² 的小肠和神经元表面积。这里使用的是商业化的 24 孔和 96 孔细胞培养板，以方便类器官的生成和整合。因此，肠道和神经元培养物的表面积略高于计算得出的最佳缩小面积--分别为 33 毫米²和 14 毫米² 。

这两个流路在重叠位置包含两个功能分离的隔室：一个用于培养荚膜细胞（模拟肾小球），另一个用于培养肾近曲小管的上皮细胞。肾脏功能单元的这种分离是为了考虑到物质过滤和重吸收进入血液流路的情况。与肝脏不同的是，细胞的体积或数量并不决定肾脏的功能，而是决定于它们为过滤和重吸收提供的表面积。如果考虑到上皮细胞的微绒毛表面，一对肾脏近端小管的完整表面积估计为 40-80 m² [20]。根据十个肝小叶对肾脏进行缩放，芯片小管区的表面必须保持在 6.7 至 26.7 毫米²之间。考虑到芯片的一般尺寸限制，我们选择了 13 毫米²的表面积  。单个人类肾小球的过滤表面为 0.17-0.21 mm²。两个人体肾脏共包含约 150 万至 200 万个肾小球。采用相同的比例系数，四器官芯片中肾小球区的表面积应为 2.6-4.2 mm² 。我们选择的芯片设计面积为 4 mm² 。调整芯片微气泵的输出，使其产生的平均剪切应力为0.1 Pa (1 dyn/cm²)（图 1D）。

人类 iPSC 分化

用于四器官芯片共培养的所有分化组织均来自同一 iPSC 株系 StemUse101/TISSUi001-A，以确保不同组织的自体培养（附图 1）。肝脏、肠道和神经元模型在放入四器官芯片前是作为单一静态培养的。同样，肾脏器官组织也是在静态培养中产生的，但细胞在分化的第 12 天消化下来，并在共培养实验开始前 6 天转移到每个芯片的肾脏流路中（附图 1）。我们在肠屏障模型中使用了立式 24孔细胞培养插入小室，以获得一个可渗透的屏障，将四器官芯片中的顶端加样空间和血液灌注流路隔开。在这里，iPSC 衍生的基质细胞床与预成型的肠组织细胞相结合。神经球的分化按照之前的描述，在生物反应器系统（DasBox, Eppendorf, Hamburg, Germany）中进行了为期 32 天的神经球分化。

建立自体四器官芯片细胞培养

所有组织模型在插入四器官芯片之前，都在其特定的 iPSC 培养基中用组织特异性生长因子或小分子建立。在共培养过程中，必须使用支持所有组织的通用循环培养基，以便器官之间通过细胞因子和其他分子交换进行交流通讯。因此，在共培养过程中，替血液液流路中使用了一种通用的低生长因子的培养基。排泄流路也使用了类似的培养基，但其中不含人 AB 血清和 ITS。两种培养基都不含葡萄糖，葡萄糖只供应给肠道器官模型的顶端。由于通过肠道模型的吸收以及随后培养基在两个流路中的循环，所有四个器官模型都得到了充足的葡萄糖供应（图 2B）。培养基由两套集成气动微泵通过微流道进行灌注，每个流路一套，提供微升量级的生理脉动液体流量。血液流路的主要流速为排泄流路的流速为 6.6 ± 0.3 μl/min，周转时间为 1.45 h。排泄流路的流速为 6.6 ± 0.3 μl/min，周转时间为 1.45 h。两个流路中富集的培养基数量微小，因此组织之间可以相互交流。μPIV分析表明，肠道和神经元培养物的灌注符合所需的标准。

在四器官芯片中建立 iPSC 衍生器官模型共培养

每天通过分析培养液中的 LDH 和葡萄糖（图 2）以及显微镜检查来评估共培养的活力和性能。后者可通过芯片的透明底部进行活组织成像。通过测量所有隔室中的 LDH 浓度（图 2A）来研究细胞的整体更替情况。与排泄流路相比，血液流路和肠道顶端区室的 LDH 浓度较高。这表明肾膜是一个扩散屏障，阻碍了葡萄糖等小分子和 LDH（140 kDa）等蛋白质的交换。同样，还测量了葡萄糖浓度，以确定所有组织是否都得到了充分供应。结果表明，仅从肠道顶部等量摄入葡萄糖，就足以同时供应胰腺和肠道。

讨论与结论

本研究成功地将来自单一供体的四种不同 iPSC 衍生组织在生理学启发的微流控装置中进行了长期共培养。共培养 14 天后，组织模型的形态和分化状态与用于 iPSC 分化的方案中公布的结果相当，尽管在四器官芯片的培养基中没有添加组织特异性生长因子。含有 5%人AB血清的基本培养基足以维持所有四种人 iPSC 衍生组织培养14 天。在肝脏和肠道模型中没有观察到再分化现象；随着时间的推移，我们甚至可以看到这些组织提前成熟。

不过，组织成熟尚未完全实现，需要进一步开发支架以及与稳定和支持细胞的共培养。最先进的 iPSC 分化方案大多不能生成完全成熟的器官培养物，而只能生成胎儿组织模型。我们的目标是使芯片中的通道和组织实现封闭的、源于 iPSC 的内皮化。这将支持使用全血提供营养和氧气，增强生理相关性，从而最终实现组织分化。

KeyGenes 预测显示，iPSC 衍生的肝脏球体与胎儿肝脏比与成人肝脏更相似（图 5A 和 B）。我们相信，随着生长因子和支架方面的 iPSC 分化方案不断改进，将会产生更成熟的细胞和组织。在肠道模型方面，14 天肠道共培养模型与成体肠道之间的KeyGenes 预测吻合度最高（图 5A）。肾脏模型是唯一没有被 KeyGenes 成功预测的组织。相反，KeyGenes 从成人或胎儿训练集中分别预测了大脑或肌肉器官（图 5A 和 B）。我们假定，在分化过程中出现的罕见肾脏器官组织是由于器官组织中的高增殖而被共存细胞过度生长的。因此，要优化分化成更纯净的肾脏器官组织的效率。肾小球的设计是一侧容纳过滤性肾细胞（如荚膜细胞），另一侧容纳内皮细胞。此外，肾小管应接收近端肾小管上皮细胞，这些细胞可将溶质和水重吸收回血路，而血路的理想内衬也是内皮细胞。虽然由于芯片设计和肾小球顶部的有机体支持多孔聚碳酸酯膜的紧密性，本研究中肠道培养物和肾脏培养物的生物屏障功能并不完整，因为没有紧密的内皮或上皮细胞层支撑屏障。尽管如此，排泄流路和血液流路之间的技术屏障仍能维持两个流路中葡萄糖和 LDH 浓度的离散性。排泄流路中的 LDH 含量远低于血液流路（图 2）。不过，在今后的实验中，需要改进屏障功能并进行验证，例如使用葡萄糖转运阻断剂。

芯片共培养 14 天后，皮质发育标记 TBR1 未出现，这证明神经元组织没有进一步成熟。另一方面，这也可以解释为神经球培养的第 50 天左右，该标记物一般较晚出现。我们相信，未来引入血脑屏障特异性内皮细胞将为神经元区提供主动的营养运输，从而使神经元模型进一步成熟或至少达到平衡。此外，每天用无葡萄糖维持培养基交换培养基以清除废物，或如 Tieng 及其同事所示在空气-液体界面下培养以增加组织的氧气供应，都可能改善神经元模型的培养条件。KeyGenes 预测显示，最初的神经元培养与胎儿组织非常相似（图 5B），但随着时间的推移，相似度有所下降，再加上 MAP2 表达量的下降，支持了培养条件尚不理想的假设。

总之，将人体自体器官模型与动态 MPS 循环中的系统交流相结合，有望显著提高模型系统的生理相关性，并最终预测药物反应。与最先进的 iPSC 衍生细胞相比，原始细胞的成熟度更高。但是，从同一供体中获取数量和质量都足以用于工业物质测试的不同组织并不可行。大量标准化 iPSC 衍生组织的产生将消除原代细胞的瓶颈。此外，使用 iPSC 衍生材料还可以对来源相同的细胞进行重复测试。