前沿进展:类器官技术—研究疾病、药物评价、再生医学的利器

前沿进展:类器官技术—研究疾病、药物评价、再生医学的利器

翻译整理:北京佰司特科技有限责任公司

类器官的基本概念

顾名思义,类器官(Organoids),即是指它类似于组织器官。其实,它本身是一种基于3D体外细胞培养系统建立的,与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型。这些3D体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态,并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。而其本身又能做到与体内分化的组织器官具有相似的生理反应,与来源组织具有极高的相似性。

与传统2D细胞培养模式相比,3D培养的类器官包含多种细胞类型,能够形成具有功能的“微器官”,能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态,因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

科学家Lancaster 和 Knoblich,这样定义类器官:

“器官特异性细胞的集合。这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来,并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out)和空间限制性的系别分化而实现自我组建”。

基于这一定义,可以发现类器官具备这样几个特征:

  • 必须包含一种以上与来源器官相同的细胞类型;

  • 应该表现出来源器官所特有的一些功能;

  • 细胞的组织方式应当与来源器官相似。

第一个类器官的诞生

回顾类器官的研究历程,必然要谈到“类器官鼻祖”——科学家Hans Clevers。

2007年,Hans Clevers 的实验室通过 lineage tracing 验发现小肠和结肠的干细胞为 Lgr5+细胞(如下图所示)。2009年,他又和自己实验室的博士后 Toshiro Sato 用来源于小鼠肠道的成体干细胞培育出了首个微型肠道类器官。

这一切是怎么发生的?Hans Clevers的实验团队将小鼠肠段中分离出来的隐窝细胞培养在含有ENR(EGF、Noggin、R-spondin)的三维Matrigel培养体系中,他们发现该培养体系下隐窝细胞能够形成类似于肠的微型结构,即隐窝-绒毛样复合体。他们也利用了该培养体系对前期分离并鉴定出来的单个 Lgr5+ 肠干细胞进行培养,发现也能形成具有上述特殊结构的类器官;追踪实验表明,该类器官仍具有 Lgr5+ 肠干细胞的存在,所以该模型能够很好地模拟体内小肠的形态结构和功能。

Hans Clevers的培养方法启发了其他科学家,他们从小鼠和人的组织中培育出多种类器官。这些类器官细胞团块小到没有血液供应仍能存活,然而又足够大和复杂,可以帮助我们了解组织和整体器官发育,以及生理病理的相关知识信息。

 目前3D类器官培养技术已经成功培养出大量具有部分关键生理结构和功能的类组织器官,比如:肾、肝、肺、肠、脑、前列腺、胰腺和视网膜等。

 

类器官的治疗潜能

类器官的研究主要集中于疾病模型,如发育相关问题,遗传疾病,肿瘤癌症等。

通过使用患者的iPSCs可建立有价值的疾病模型,并能在体外模拟重现病人疾病模型;同时,类器官的建立可以实现对药物药效和毒性进行更有效、更真实的检测。由于类器官可以直接由人类iPSCs直接培养生成,相比于动物模型很大程度上避免了因动物和人类细胞间的差异而导致的检测结果不一致。

 

类器官在癌症治疗中的研究

目前,类器官多用于肿瘤癌症的研究中。观察下图中临床前肿瘤癌症模型的比较,可以发现类器官有着很强的优势:

1.  药效和毒理测试

类器官的培养可用于临床前癌症的治疗检测及药物药效和毒性测试。在转化医学的研究中,类器官也发挥着不可小觑的作用,并逐渐走向肿瘤癌症基础研究和临床治疗的中央舞台。

可以从患者来源的健康和肿瘤组织样品中建立类器官。与此同时类器官培养物可用于药物筛选,这可将肿瘤的遗传背景与药物反应相关联。来自同一患者健康组织的类器官的建立提供了通过筛选选择性杀死肿瘤细胞而又不损害健康细胞的化合物来开发毒性较小的药物的机会。自我更新的肝细胞类器官培养物可用于测试潜在新药的肝毒性(临床试验中药物失败的原因之一)。在该实施例中,药物B似乎最适合于治疗患者,因为它特异性杀死肿瘤类器官并且不引起肝毒性。

2. 类器官“生物银行”

根据目前的研究进展,建立了活体类器官“生物银行”。其中,肿瘤来源的类器官在表型和基因上都与肿瘤的上皮相似。另外,肿瘤类类器官生物库使生理学相关的药物筛选成为可能。活体类器官生物库可用于确定类器官是否对个体患者的药物反应,具有预测价值。

3. 重演肿瘤形成

类器官的培养和建立,可用于研究肿瘤生成过程中的突变过程,比如说,通过从同一肿瘤的不同区域培养无性繁殖的类细胞器,可以用来研究肿瘤内部的异质性。

来自不同健康器官的类器官的生长,然后对培养物进行全基因组测序,可以分析器官特异性突变谱。通过生长来自同一肿瘤不同区域的类器官,可以用于研究肿瘤内异质性。区域特异性突变谱可以通过类器官的全基因组测序来揭示。使用与上述相似的方法,可以利用类器官来研究特定化合物对健康细胞和肿瘤细胞突变谱的影响。

癌症是由致病基因突变的逐渐积累引起的。因此,了解在组织稳态和肿瘤发生过程中活跃的突变过程是很重要的。

 

类器官---体外模型崛起新星:

iPS/ES 或成体干细胞为起点,在 3D 环境下,利用细胞因子将干细胞分化成具有各种器官主要组织细胞类型及组织特征的微型结构。类器官虽然是一种体外培养方法,但类器官在很大程度上可以模拟体内的生理环境,具有众多优势:

  • PDOPatient Derived Organoid)对于候选药物有较高的预测能力,且适用于高通量培养,因此可以用来建库,作为有效的药物筛选平台;
  • 由于类器官的生长时间较短(数周),可以用作临床试验或患者用药指导的工具,具有开发成精准诊断平台的潜力;
  • 由于类器官是由单一干细胞分化而来的,作为分化前体的干细胞可以经过各种基因编辑或转基因技术的改造,用于研究肿瘤的发病机理。

 

类器官可以模拟人体的内外环境和人体器官,帮助研究人员观测用药会对人体器官功能产生什么样的影响。在提倡精准医学和个体化治疗的时代,类器官研究比传统的二维细胞培养更具有针对性,并且可以区别不同癌症对于相同药物的反应。不仅如此,研究者还希望通过诱导多功能干细胞强大的再生潜能,体外生成新的器官或组织,然后移植入体内以替代损坏的组织器官。

   

   

 

类器官的应用案例

肠类器官:HansClever 课题组证实单一的Lgr5 +干细胞能够在体外持续增殖并自组装形成隐窝-绒毛样的小肠上皮结构。进一步的研究结果显示,单个成人Lgr5 + 干细胞也能在体外成功扩增成结肠类器官,将这种功能性的结肠上皮移植到硫酸葡聚糖诱导的急性结肠炎小鼠模型中可以修复其受损的结肠上皮。这提示利用单一成人结肠干细胞体外扩增进行结肠干细胞治疗是可行的。有学者还应用人诱导型多能干细胞( induced pluripotent stem cellsiPSCs) 直接定向分化为小肠组织的方法明确了Wnt3a 蛋白和成纤维细胞生长因子4 是后肠特定分化所必需的物质,而且,这种iPSCs体外构建的人体肠道组织中存在的小肠干细胞,也具有小肠特有的吸收和分泌功能。这有助于未来人肠道疾病药物的设计研究,可大大提高了药物利用率。目前,已有学者构建了小鼠小肠3D 类器官来进行P-糖蛋白抑制剂的筛选,为P-糖蛋白介导的药物转运研究提供了强有力的工具。

肝类器官:2013 年,Takebe 等将人多能干细胞来源的肝细胞、人间充质干细胞和人内皮细胞混合后在基质胶中培养,发现3 种细胞自组装成3D 化肝芽,将该肝芽移植到丙氧鸟苷诱导肝脏衰亡的TKNOG 小鼠体内后发现这种肝芽可以连接小鼠肠系膜血管,小鼠也出现了人类特有的药物代谢过程。这为肝脏器官发生的研究提供了有益尝试。大型哺乳动物的类器官再造工程也许能加速人类器官移植治疗和疾病致病机制研究的进展。2015 年,Nantasanti 等利用狗的肝脏干细胞构建了可分化为功能性肝细胞的肝类器官模型,能用于铜潴留症的治疗。猫被认为是非常适用于研究人类代谢性疾病的模型,所以利用猫的胆道组织构建肝类器官,可能是原发性肝胆疾病研究及药物筛选的有益工具,但至今也未见利用猫建立长期保持基因稳定的肝脏干/祖细胞培养体系的报道。

胰腺类器官:有学者发现,当控制骨形态发生蛋白碱性成纤维细胞生长因子、激活素A Wnt3a 的表达水平或使用一些小分子化合物进行干预时,可以控制内胚层细胞向特定的方向分化,最终形成胰腺。目前,构建胰岛类器官的主要方法包括利用各种干祖细胞产生胰岛样细胞群和利用各种来源的胰腺细胞悬液或胰腺组织块自组装成拟胰岛体。2011 年,Saito 等将人iPSCs 和胚胎小鼠胰岛细胞体外共培养,最后形成能够产生胰岛素的不成熟细胞群,该细胞群由胰岛α 细胞包绕中央的β 细胞构成,这种结构和成年鼠胰岛相似,将其移植到链脲菌素诱导的高血糖小鼠模型中后发现小鼠血糖水平得到极大改善。而进一步的体内实验研究还需要关注如何规避免疫反应、促进再血管化、促进类器官分化发育等问题,在这方面,Sabek 等提出制备纳米腺体来促进胰岛发挥作用,这种纳米腺体是运用3D 打印技术制作可吸收聚合物胶囊包裹胰岛样细胞团形成的,这可能是未来胰岛类器官应用的一种思路。

脑类器官:近来,谱系重编程技术为获取特异性种子细胞提供了新的途径。Lancaster 等通过加入不同生长因子的方法将人类胚胎干细胞( embryonic stem cellESC) iPSC 在神经培养基3D 培养出了与9 10周胚胎大脑类似的“类大脑”,此类迷你大脑具备人类大脑发育初期的一些主要区域,也出现了背侧皮层、腹侧前脑等可辨认的特征,但由于缺乏一些特定的特征,如小脑、海马状突起等,这些区域无法应用于干细胞模型。之后,该研究者利用小颅畸形患者的皮肤成纤维细胞诱导形成了患者特异性iPSC 细胞系,并应用后者构建了小颅畸形脑类器官模型,通过对照实验发现,正常ESC和该iPSCs 在类器官形成上并没有明显差异,但是后者形成的类器官中有大量未成熟的神经元分化,这为大脑发育紊乱类疾病的研究提供了一定的思路。2015Kirwan 等应用人iPSC 体外构建了人大脑皮层神经网络,能够模拟人体内皮层网络的发育和功能,这表明可以在体外通过构建大脑类器官来进行人类前脑神经网络生理学机制的研究。

前列腺类器官:2014 年,研究人员首次在实验室利用来自转移性前列腺癌患者的活检标本和去势抵抗性前列腺癌( castration-resistant prostate cancerCPC) 患者的循环肿瘤细胞成功培育出7 个前列腺癌类器官,这些前列腺癌类器官以及从中获得的肿瘤移植物的组织结构及基因突变谱与患者转移灶样本高度相似。Nicholson 等[21]也应用类器官培养技术成功在体外构建患者来源的异种移植物模型,相比于人源性肿瘤组织异种移植及基因工程鼠模型,这种新型的患者来源的类器官能更好地代表CPC 等高级别前列腺癌,还能代表前列腺癌的庞大临床疾病谱,而这种疾病谱是目前仅有的前列腺癌细胞系无法代表的,因而在前列腺癌药物筛选和个体化治疗中展现出巨大的应用前景。

 

国际类器官行业现状

类器官培养技术目前正处于技术爆发和科研成果井喷的阶段,行业发展具有很大的前景,但也面临较大的挑战。比如如何利用好人体胚胎的干细胞建立持久稳定的体外模型;培养条件和环境刺激如何更真实的模拟还原人体微环境;科研属性的产品如何实现量产,如何转化为临床产品等。

根据Meticulous Research Analysis的资料显示:2016年,3D组织培养在全球细胞分析检测市场占据了约9.3%的份额。2017年市场价值8.181亿美元,在预计期内将以8.7%的年复合增长率增长,2022年达到12.426亿美元。其中,美国在全球3D细胞市场贡献了约34.8%的主要份额,位居全球首位。2016年,中国在全球3D细胞市场占5%的份额,远不及美国,但预计未来五年中国将以11.8%的年复合增长率增长,成为年复合增长率最高的国家,具备市场发展潜力。

 

类器官领域的供应商

类器官培养仪器:

德国TissUse公司的类器官培养系统,2010年成立,起源于柏林工业大学,稳定的第三方融资(非风险投资),基于收入的财务独立性,30 名研究员 + 22 名其他员工,9 项专利族 + 117 项专利,

类器官培养相关试剂:

试剂厂商Sigma-Aldrich(现被Merck收购),ThermoFisher,也有一批取得较大成就的创业型公司。包括瑞士的提供无支架三维细胞培养产品的InSphero公司,加拿大最大的生物科技公司STEMCELL Technologies提供专业的细胞培养基和细胞分选产品,和提供体内微环境模拟系统的美国公司Xcell Biosciences等。

类器官培养相关耗材:

3D细胞培养提供试剂和材料原料,包括提供细胞支架材料、胞外基质、细胞生长因子、培养基和生物反应器等的一些公司。包括老牌的试剂厂商:Sigma-Aldrich(现被Merck收购),ThermoFisher,创业型公司,包括提供无支架三维细胞培养产品的瑞士的InSphero公司,提供专业的细胞培养基和细胞分选产品的加拿大最大的生物科技公司STEMCELL Technologies,和提供体内微环境模拟系统的美国公司Xcell Biosciences等。

 

 

 

 

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com):

类器官串联芯片培养仪-HUMIMIC;灌流式细胞组织类器官代谢分析仪-IMOLA;光片显微镜-LSM-200;

蛋白稳定性分析仪-PSA-16;单分子质量光度计-TwoMP;超高速视频级原子力显微镜-HS-AFM;

全自动半导体式细胞计数仪-SOL COUNT;农药残留定量检测仪—BST-100;台式原子力显微镜-ACST-AFM;微纳加工点印仪-NLP2000/DPN5000;

 

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创建时间:2020-09-03 16:49