应用案例：  蛋白稳定性分析仪PSA-16助力心梗的机制研究和药物开发

蛋白稳定性分析仪PSA-16助力河南大学抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室的科研工作者于 2025年3月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上发表“Attenuation of cardiac ischemia/reperfusion injury via the decoy receptor DcR2 by targeting the PLAD domain of the death receptor DR5”论文。

本研究旨在确定 DcR2 的作用靶点，并探究 DcR2 在小鼠心肌 I/R 损伤中的心肌保护机制。结果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白对心肌缺血/再灌注损伤具有显著的保护作用。DcR2 通过其 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物，该结构域不具有完整的死亡结构域，因而无法向下游传递信号。此外，复合物的形成掩盖了与配体 TRAIL 相互作用的位点，从而减轻了缺血/再灌注损伤后的心肌细胞死亡。因此，本研究揭示了 DcR2 的 PLAD 结构域在抑制细胞凋亡中起关键作用，为新型药物的研发提供了潜在靶点。

Lijie Zhang, Xinyuan Zhang, Ziting Li, Tingting Mo, Wanting Feng, JingLun Zhang, Dan Zhao, Ying Wang, Yinxiang Wei, Yaohui Wang

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, the First Affiliated Hospital, Henan University, Kaifeng, China

School of Medicine, Henan University, Kaifeng, China

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, Henan University, Kaifeng, China

Zhou, D. et al.

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度（Tm）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

01 摘要

缺血缺氧导致的心肌细胞死亡是心肌损伤的主要原因。DcR2 是 TRAIL 的诱骗受体，DcR2 在心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中的作用尚不清楚。近期研究表明，DcR2 不仅作为受体与 TRAIL 结合，还能作为 DR5 的配体在体外阻断 TRAIL 诱导的细胞凋亡，但 DcR2 在体内对 TRAIL 或 DR5 的亲和力偏好尚不清楚。之前的研究发现，hDcR2-Fc 融合蛋白在小鼠心肌 I/R 损伤模型中发挥心脏保护作用，通过减少细胞凋亡来实现。亲和力测定表明，DcR2 对 DR5 的亲和力大于对 TRAIL 的亲和力，且 DcR2 更倾向于与 DR5 结合。机制研究表明，PLAD 的缺失消除了 hDcR2-Fc 对 I/R 引起的心肌损伤的保护作用。DcR2 通过类似的 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物。综上所述，本研究揭示了 DcR2 可通过 PLAD 结构域靶向 DR5 形成异源复合物，阻断细胞凋亡，从而改善心肌 I/R 损伤，为心肌 I/R 损伤的治疗提供了新的预防策略。

02 简介

急性心肌梗死（AMI）是一种严重威胁人类生命健康的疾病，全球范围内 AMI 的死亡率仍然很高。由缺血缺氧引起的心肌细胞死亡是一种不可逆的损伤。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）能有效降低急性心肌梗死患者的死亡率，但存在两大难题，即治疗的黄金时间短以及缺血/再灌注（I/R）损伤。此外，长期心力衰竭的发生率也很高。为了缩小心肌梗死的范围，延长心肌细胞死亡的“窗口期”，改善患者的长期预后，需要研发能够减少或逆转心脏损伤的新疗法。

心肌梗死通常伴有多种病理变化，其中最严重的是心肌细胞凋亡。然而，临床上尚无治疗心肌细胞凋亡的有效策略。因此，寻找预防心肌细胞凋亡的关键靶点可能为心肌梗死的预防和治疗提供新的策略。肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL），也称为Apo2配体，属于TNF配体超家族。迄今为止，人类已鉴定出五种TRAIL受体。DR4（TRAIL-R1）和DR5（TRAIL-R2）被称为死亡受体（DRs），它们具有完整的死亡结构域（DD），能够传递由TRAIL调节的死亡信号。DRs介导相关下游信号通路的激活，从而导致细胞凋亡，其中DR5是主要的死亡受体。作者之前的研究证实sDR5-Fc融合蛋白可以特异性阻断TRAIL-DR5通路，从而改善猴、猪、大鼠心肌梗死后的心功能。

03 结果

在缺血/再灌注损伤中，DcR2 与 DR5 之间的配体非依赖性相互作用抑制了 TRAIL 诱导的细胞凋亡

先前的研究表明，DcR2 和 DR5 可能通过 PLAD 结构域结合。为了确定 PLAD 是否介导 DcR2 与 DR5 的结合，作者制备了 PLAD 结构域缺失的 DcR2ΔPLAD-Fc 融合蛋白（图 5A）。PLAD 结构域的去除并未影响DcR2 的二级结构，但其熔解温度（Tm）略有下降，表明其稳定性有所减弱（图 5B）。

N-糖基化缺陷的 DCR2 仍能阻断细胞凋亡

目前，关于 DcR2 糖基化作用的研究尚不充分，糖基化如何调节 TRAIL 诱导的细胞凋亡以及 DcR2 与受体和配体的结合机制仍不清楚。由于 N 连接糖基化（N-糖基化）在肿瘤坏死因子（TNF）家族的其他成员中起着调节作用，作者研究了 N-糖基化对 DcR2 功能的调节作用。虽然人类 DR5 序列中没有潜在的 N-糖基化位点，但人类 DR4 的 CRD2 区域在 156 位的天冬酰胺上存在 N-糖基化。DeR2 在 95、139 和 150 位的三个天冬酰胺上具有三个潜在的 N-糖基化位点。为了探究 N-糖基化对 DeR2 功能的影响，将 DCR2 的三个 N-糖基化位点从天冬酰胺突变为谷氨酰胺（图 6A）。首先，测试了蛋白的稳定性，热变性曲线显示突变后 Tm 值略有下降（图 6B）。

04 方法

差示扫描荧光法

融合蛋白的热稳定性通过 PSA-16 型仪器（北京佰司特科技有限责任公司）测定。将样品稀释至 0.5 毫克/毫升，取 20 微升稀释后的样品装入石英玻璃管（货号：LG-002，北京佰司特科技有限责任公司）。在 30 至 90 摄氏度的线性温度扫描范围内，以每分钟 1 摄氏度的升温速率测量 330 纳米和 350 纳米处的固有蛋白质荧光强度。根据 F350/F330 曲线的斜率计算热变性中点（Tm）。每个样品测量三次。

05 讨论

本研究证明了 DcR2 在减轻 1/R 诱导的心脏损伤方面具有显著效果，并揭示了在小鼠 1/R 损伤疾病模型中，DcR2 更倾向于与 DR5 结合。为开展此项研究，我们表达并纯化了一系列蛋白质，包括 hDcR2-Fc、Fc-hDcR2、DR5-Fc、DR5-His、TRAIL、DCR2APLAD-Fc 和 Mu-N-Gly-DcR2-Fc。通过蛋白质特性分析，我们确定 hDcR2-Fc 具有更强的抗凋亡作用。在双盲条件下进行的小鼠心肌 1/R 损伤实验结果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白通过减少心肌细胞凋亡程度发挥心脏保护作用。先前的研究报告称，DcR2 还可作为 DR5 的配体，在体外阻断 TRAIL 诱导的细胞凋亡，但这一发现尚未在体内得到验证。我们的研究阐明了 DcR2 与 DR5 的亲和力大于其与 TRAIL 的亲和力，且 DcR2 更倾向于与 DR5 结合。深入研究其机制后，我们发现 DcR2 通过类似的 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物。由于缺乏完整的死亡结构域，DeR2-DR5 复合物无法激活下游的细胞凋亡信号，从而有效减轻了 1/R 引起的心脏损伤（图 5）。此外，我们对 DeR2 的 N 糖基化位点进行了突变，发现未进行 N 糖基化的 DeR2 蛋白仍能阻断细胞凋亡（图 6）。总之，本研究为治疗心肌 1/R 损伤提供了新的治疗靶点。

我们之前已证实 DR5-Fc 融合蛋白可通过靶向 TRAIL 来阻断细胞凋亡并发挥心脏保护作用。在本研究中，我们进一步证明了通过靶向 DR5，DCR2通过与 DRS 形成无功能的异三聚体来阻止细胞凋亡。针对 TRAIL-DR5 通路的临床药物研发有所增加[25-27]。人类 TRAIL 有 5 种受体。过去，人们认为死亡受体 DR5 和 DR4 起主要作用，而对其他诱骗受体关注较少。我们的研究表明，在病理状态下，应更多地关注 TRAIL 的几种受体是如何平衡的。TRAIL 被认为是肿瘤治疗的极佳治疗靶点，因为它能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响。目前，仅有一种药物——环化突变型 TRAIL（CPT）于 2023 年获批，而针对 TRAIL 开发药物的主要困难在于克服其耐药性[28]。多项研究将 TRAIL 耐药性与死亡受体和诱骗受体的比例改变联系起来，DR4/DR5 表达降低和诱骗受体表达增加可能导致 TRAIL 耐药性的产生。我们的研究还表明，DcR2 的功能不容忽视。有必要进一步研究 DcR2 在癌症和其他疾病中的作用。

DcR2 的 PLAD 结构域是如何发挥作用的？作为一种死亡受体，DcR2 属于肿瘤坏死因子受体超家族，但与 TNFRI 及其他成员有所不同。首先，TNFR1 有四个 CRD 结构域，每个结构域包含三个二硫键，共 6 个半胱氨酸。而 Fas 和 DR4/DR5/DcR1/DcR2 只有三个 CRD 结构域，且只有部分 CRD1。DR4/DR5/DcR1/DcR2 的 CRD1 结构域只有一个二硫键。肿瘤坏死因子受体的配体前组装已被公认为激活的必要前提。其他 TNFR 受体只能通过 PLAD 结构域自组装，而不能与其他受体结合。然而，DR5 和 DcR2 能够形成异三聚体复合物，因为 TNFR 家族成员在 CRD1 区域有更多的二硫键相互作用，而 DR4/DR5/DcR1/DcR2 在 CRD1 区域只有一个二硫键。此外，DR5 和 DcR2 的 CRD1 区域较短，且 DcR2 的 PLAD 结构域与 DRS 相似，因此它们能够形成复合物。还需要进一步研究来探索其中的详细机制。此外，我们还研究了 N-糖基化对 DCR2 功能的影响，并报告称未进行 N-糖基化的 DCR2 蛋白仍能发挥阻断细胞凋亡的作用，这为开发 DcR2 相关药物奠定了基础。

我们的研究存在一些局限性。在小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中证实了 hDcR2-Fc 的心脏保护作用，但小鼠诱骗受体 2（mDCTRAIL-R2）的氨基酸序列与人 DCR2 差异很大，仅有 27.37% 的同源性。此外，小鼠 TRAIL 与人受体的相互作用很强。由于猴和人的 TRAIL/TRAIL 受体具有高度相似性（84-99% 的同源性），有必要进一步在猴缺血/再灌注模型中探究 hDCR2-Fc 蛋白的心脏保护作用。hDCR2-Fc 在心肌缺血/再灌注损伤中的具体靶细胞尚未明确，还需要进一步研究以确定 DCR2-Fc 对关键心脏细胞（包括心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞）的影响。已发现 DR5 的 O 连接糖基化（O-glyc）可调节促凋亡信号，DR5 的 O-glyc 位点位于 CRD2 和 CRD3 内或其周围。通过 NetOGlyc 预测 DCR2 的 O-glyc 位点，发现 DCR2 比 DR5 拥有更多的 O-glyc 位点，尤其是在 CRD1 区域。阐明 O-糖基化在 DeR 中的作用将是未来研究的有趣方向。

总之，我们的研究证明了 DCR2 在减轻急性心肌梗死后的再灌注损伤方面具有保护作用。机制研究阐明，DCR2 通过其 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物，该结构域不具有完整的死亡结构域，因而无法诱导细胞凋亡级联反应。此外，复合物的形成掩盖了与配体 TRAIL 的结合位点，从而减轻了再灌注损伤后的心肌细胞死亡。本研究证实了针对 DR5 进行靶向治疗的可行性，并为开发针对 TRAIL-DRS 通路的临床药物提供了更广阔的发展空间。

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)

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