文献转载：科学家成功开发尼帕病毒新型疫苗

 

 

2024年8月份，武汉大学病毒学国家重点实验室科研工作者于在Nature子刊《npj Vaccines》杂志上发表论文“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadlyneutralizing antibodies and protects againstlethal Nipah virus infection”。本研究以尼帕病毒G蛋白头部域为抗原靶标，成功开发出一种新型的、安全有效的自组装蛋白纳米颗粒疫苗，该疫苗能够诱导抑制多种亨尼帕病毒感染的广谱中和抗体，并对尼帕病毒感染的仓鼠提供完全保护。​

Zhou, D. et al. 

npj Vaccines 9, 158 (2024).

https://doi.org/10.1038/s41541-024-00954-5

 

前言

尼帕病毒（NiV）是一种新发的人畜共患副粘病毒，可导致人类严重的脑炎和呼吸道感染，病死率高达40%至75%。目前，尚未批准针对NiV的人用疫苗或抗病毒药物。本研究设计了一种基于铁蛋白的自组装纳米颗粒，其表面展示NiV G头部结构域（NiV G-铁蛋白），并评估了可溶性NiV G头部结构域（NiV sG）或NiV G-铁蛋白引发的免疫反应。使用NiV G-铁蛋白或NiV sG进行免疫接种，可在叙利亚金黄仓鼠中提供完全保护，使其免受致死性NiV攻击，且未检测到病毒RNA。与NiV sG相比，NiV G-铁蛋白诱导的血清中和反应显著更快、更广、更强，针对三种致病性亨尼帕病毒（NiV-马来西亚、NiV-孟加拉和亨德拉病毒）。此外，NiV G-铁蛋白在小鼠中诱导了持久的中和免疫力，即使在第三次免疫接种六个月后，抗血清仍能有效抑制NiV感染。此外，我们从NiV G-铁蛋白免疫的小鼠中分离出一组27种NiV G结合单克隆抗体（mAbs），发现这些mAbs靶向NiV G头部结构域的四个不同抗原位点，其中两个位点此前尚未被定义。值得注意的是，25种分离的mAbs具有强效中和活性，对NiV假病毒的50%抑制浓度低于10 ng/mL。综上所述，这些发现为NiV G蛋白的免疫原性提供了新的见解，并揭示NiV G-铁蛋白是一种安全且高效的尼帕病毒感染疫苗候选物。

 

摘要

尼帕病毒（NiV）是一种负链单链RNA病毒，最初于1998年至1999年间在马来西亚和新加坡的疫情中被分离和鉴定。自首次疫情以来，马来西亚和新加坡的尼帕病毒感染病例较少，直至2001年，此后尼帕病毒疫情几乎每年在孟加拉国发生。最近，2023年印度喀拉拉邦爆发了尼帕病毒疫情，导致6人感染，其中2人死亡。尼帕病毒感染可引发严重的脑炎和呼吸道疾病，病死率高达75%。此外，幸存者中还观察到长期神经系统症状和尼帕病毒感染的复发。目前，尚无获批用于人类的疫苗或治疗方法。

尼帕病毒属于副粘病毒科亨尼帕病毒属（HNV），该属还包括另一种高致病性病毒——亨德拉病毒（HeV）。此外，近年来不断有新的亨尼帕病毒样病毒被报道，如雪松病毒（CedV）、加纳病毒（GhV）、墨江病毒（MojV）和琅琊病毒（LayV）。根据病毒的地理分布和遗传多样性，尼帕病毒被分为两个谱系：马来西亚尼帕病毒（NiV-M）和孟加拉国尼帕病毒（NiV-B）。尼帕病毒具有广泛的宿主嗜性，包括蝙蝠、猪、狗、猫、马、豚鼠和仓鼠。人类主要通过接触感染动物（如蝙蝠和猪）和食用受污染的食物感染，尽管直接人际传播也屡有报道，这凸显了亨尼帕病毒对全球健康的潜在风险。世界卫生组织（WHO）已将亨尼帕病毒感染列为需要广泛和紧急研究的优先疾病，以开发应对措施。

尼帕病毒编码两种病毒膜蛋白，即糖蛋白（G）和融合蛋白（F），它们位于病毒表面，协同作用帮助病毒进入靶细胞并启动感染。先前研究表明，酪氨酸激酶ephrin-B2和ephrin-B3是尼帕病毒和亨德拉病毒的受体，G蛋白负责受体识别和结合。受体结合后，G蛋白经历一系列构象变化，激活F蛋白启动并完成与靶细胞的膜融合。此外，许多中和和保护性抗体主要靶向G和F蛋白，表明这两种病毒蛋白是疫苗开发的关键抗原。

近年来，已开发出多种针对尼帕病毒感染的疫苗平台，包括亚单位疫苗、mRNA疫苗、病毒样颗粒（VLPs）、病毒载体疫苗和DNA疫苗，但尚未评估自组装纳米颗粒平台用于尼帕病毒感染。作为纳米颗粒疫苗载体，铁蛋白可自组装成由24个相同亚基排列而成的八面体笼状结构，并多价展示抗原。纳米颗粒的抗原多聚化特性可能允许B细胞受体的多价结合，从而有利于B细胞激活并引发针对递送抗原的强效免疫反应。由于这些优势，该递送系统已广泛应用于针对多种传染性病原体和肿瘤的疫苗开发，包括流感疫苗、EB病毒疫苗和COVID-19疫苗。

在本研究中，我们设计并表征了一种基于铁蛋白的纳米颗粒疫苗，该疫苗展示尼帕病毒G蛋白的头部结构域（NiVG-ferritin）。接种NiVG-ferritin疫苗在小鼠中诱导了快速、强效且持久的针对尼帕病毒的体液免疫反应，显著优于可溶性尼帕病毒G头部结构域（NiV sG）的接种。此外，三剂接种NiV G-ferritin或NiV sG可完全保护叙利亚金仓鼠免受致死性尼帕病毒感染。我们还分离了27种具有不同尼帕病毒感染抑制活性的抗NiV-G单克隆抗体（mAbs），并发现这些mAbs识别尼帕病毒G上的四个不同抗原位点，其中包括两个先前未识别的新位点。我们的工作提供了一种潜在的尼帕病毒候选疫苗，并证明G头部结构域是尼帕病毒疫苗开发的优秀抗原。

作者设计了一种基于铁蛋白的自组装纳米粒子，在表面显示NiV G头部结构域（NiV G-铁蛋白，NiV G-ferritin），并评估了可溶性NiV G头结构域（NiV sG）或NiV G-铁蛋白引发的免疫反应，并且通过一系列研究数据表明NiV G铁蛋白是一种安全有效的尼帕病毒感染候选疫苗。

 

 

结果

尼帕病毒G蛋白纳米颗粒免疫原的设计与制备

既往研究表明，受体结合位点位于尼帕病毒G蛋白头部结构域，该区域是大多数中和性和保护性单克隆抗体的作用靶点。在已报道的自组装纳米颗粒系统中，我们选择幽门螺杆菌-牛蛙杂交铁蛋白（简称铁蛋白）作为载体，因其可最大限度地降低疫苗诱导的自身免疫反应，且铁蛋白展示的免疫原能够增强动物对其他病毒的免疫应答38,41。为在铁蛋白表面均匀展示尼帕病毒G蛋白头部结构域，将尼帕病毒G蛋白C端（残基176-602）与铁蛋白N端延伸序列融合（以下简称NiV G-铁蛋白）。同时，在尼帕病毒G蛋白头部结构域N端融合信号肽，用于在Expi293F细胞中进行真核分泌表达。

考虑到可溶性蛋白形式的尼帕病毒G蛋白头部结构域与铁蛋白纳米颗粒展示形式可能存在抗原性差异，我们使用相同系统表达并纯化了尼帕病毒sG蛋白。同时，设置不含抗原的纯铁蛋白作为阴性对照（图1a）。尺寸排阻色谱（SEC）分析显示，NiV G-铁蛋白的洗脱峰早于纯铁蛋白和尼帕病毒sG蛋白（图1b）。值得注意的是，在免疫期间，无论是1 μg/剂还是10 μg/剂免疫小鼠，NiV G-铁蛋白诱导的假病毒中和抗体和NiV G结合IgG滴度均高于尼帕病毒sG蛋白（图2b-e）。随着免疫剂量增加，两组小鼠的NiV G结合IgG和假病毒中和抗体滴度均稳步提升，且NiV G-铁蛋白在诱导NiV G结合和中和血清抗体方面比尼帕病毒sG蛋白更有效，但在某些时间点差异未达到统计学显著性（图2b-e）。为验证假病毒中和数据，我们在最后一次免疫后三周（第61天）检测了血清对真实尼帕病毒-M株的中和活性。结果显示，NiV G-铁蛋白组的血清几何平均NT50滴度高于尼帕病毒sG蛋白组（1 μg组约高6倍，10 μg组约高2倍），但未达到统计学显著性（图2f）。如预期，纯铁蛋白未能诱导尼帕病毒特异性抗体反应（图2b-f）。在NiV G-铁蛋白和尼帕病毒sG蛋白免疫组中均未观察到NiV G特异性细胞免疫反应（补充图1a，b），表明NiV G纳米颗粒成功组装。SDS-PAGE分析显示，NiV G-铁蛋白、尼帕病毒sG蛋白和铁蛋白分别在70 kDa、50 kDa和19 kDa处呈现高纯度条带，与其各自单体形式的预测分子量接近（图1c）。我们进一步通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）测定了NiV G-铁蛋白和尼帕病毒sG蛋白的分子量。NiV G-铁蛋白的蛋白质组分计算分子量约为1.5 MDa，相当于约21个单体NiV G-铁蛋白，表明NiV G-铁蛋白多价展示G蛋白头部结构域。尼帕病毒sG蛋白的平均蛋白质组分分子量为48.8 kDa，与预期分子量（48.7 kDa）一致（图1d）。

NiV G-铁蛋白的表征与抗原特性

我们随后通过负染电子显微镜（nsEM）观察了纯铁蛋白和NiV G-铁蛋白的整体结构。nsEM图像显示，铁蛋白和NiV G-铁蛋白均形成分散的球形颗粒，未见聚集现象（图1e）。二维分类平均图清晰显示，与纯铁蛋白相比，NiV G-铁蛋白表面呈刺突状（图1e），测得NiV G-铁蛋白和铁蛋白组装颗粒的直径分别约为22 nm和12 nm，表明NiV G头部结构域展示在铁蛋白纳米颗粒表面。动态光散射（DLS）分析显示，NiV G-铁蛋白的流体力学直径（约29.4 nm）远大于尼帕病毒sG蛋白（约12.7 nm）和纯铁蛋白（约23.5 nm）（图1f）。NiV G-铁蛋白的多分散指数（PDI）小于10%，表明其尺寸分布均一（图1f）。差示扫描荧光法（DSF）结果显示，NiV G-铁蛋白和尼帕病毒sG蛋白具有相似的热稳定性，Tm值约为65°C，表明NiV G与铁蛋白的融合对其结构稳定性无显著影响（图1g）。

接下来，我们使用已报道的抗体HENV-32、HENV-26和nAH1.3检测NiV G-铁蛋白的抗原性。HENV-26识别G蛋白头部结构域的受体结合位点，而HENV-32和nAH1.3在G蛋白上有两个不同的结合位点，且不与HENV-26或病毒受体ephrin-B2竞争43,44。酶联免疫吸附试验（ELISA）结果显示，抗体HENV-32、HENV-26或nAH1.3均能与NiV G-铁蛋白和尼帕病毒sG蛋白相互作用。如预期，阴性对照抗体（RVC20，一种已报道的抗狂犬病毒单克隆抗体45）未观察到结合信号，表明NiV G-铁蛋白对这三种抗体的反应性与尼帕病毒sG蛋白相似（图1h）。

NiV G-铁蛋白在小鼠中诱导强烈的抗体反应

为评估NiV G-铁蛋白的免疫原性，我们使用AddaVax佐剂的NiV G-铁蛋白、尼帕病毒sG蛋白或纯铁蛋白对BALB/c小鼠进行三次肌肉免疫，并在整个免疫过程中收集血清（图2a）。免疫剂量根据纳米颗粒组装和NiV G头部结构域的分子量计算，以确保使用等量的G蛋白进行直接比较。小鼠分别免疫1 μg或10 μg尼帕病毒sG蛋白，或含有相应量NiV G头部结构域的NiV G-铁蛋白。在初次免疫后每周（第7、14和21天）以及第二次和第三次免疫后三周（第42和61天）采集血液，检测NiV G结合IgG滴度（半数有效浓度[EC50]）和中和滴度（半数抑制浓度[NT50]）。

令人惊讶的是，在首次免疫NiV G-铁蛋白后7天，小鼠血清中即检测到NiV G结合IgG（几何平均EC50，1 μg组为1:157，10 μg组为1:399）和假病毒中和滴度（几何平均NT50，1 μg组为1:54，10 μg组为1:178）（图2b，c）。相比之下，尼帕病毒sG蛋白免疫小鼠血清中的NiV G结合IgG和假病毒中和滴度在首次免疫后7天低于检测限，表明NiV G纳米颗粒在免疫小鼠中比尼帕病毒sG蛋白更具免疫原性，这可能是由于我们使用的检测方法的敏感性，或NiV G头部蛋白在可溶性形式或纳米颗粒背景下主要诱导体液免疫反应。

在首次和第二次免疫后三周（第21和42天），10 μg尼帕病毒sG蛋白免疫小鼠的NiV结合IgG和假病毒中和滴度比1 μg组高约4至26倍（图2b-e）。而对于NiV G-铁蛋白免疫组，10 μg组血清NiV结合IgG和假病毒中和滴度仅在首次免疫后（第7、14和21天）较高，但在第二次和第三次免疫后（第42和61天）未观察到抗体反应增强。此外，第三次免疫尼帕病毒sG蛋白后，1 μg和10 μg组的NiV假病毒中和滴度分别增加了约135倍和5倍。相比之下，第三次免疫NiV G-铁蛋白后，中和滴度仅比第二次免疫后提高了约3倍。这些结果表明，与可溶性对应物相比，NiV G-铁蛋白纳米颗粒增强了抗原特异性IgG滴度和中和效力，并表现出剂量节约和剂量减少的特性。

NiV G-ferritin诱导广泛的抗体反应  

我们随后通过ELISA检测了免疫小鼠在第61天（最后一次免疫后约三周）血清对重组NiV-B、HeV、MojV和LayV G头蛋白的交叉反应性。结果显示，NiV sG和NiV G-ferritin免疫小鼠的血清均能交叉结合NiV-B和HeV的G头蛋白。与NiV sG相比，NiV G-ferritin诱导了更高的NiV-B和HeV G头蛋白交叉结合IgG滴度，尽管在1 μg组中对HeV G的统计学显著性未达到（图3a, c）。此外，针对NiV-B的血清交叉反应性IgG滴度高于HeV（倍数变化：约5至15倍），可能是由于NiV-B与NiV-M的亲缘关系比HeV更近。对于MojV和LayV，未在免疫小鼠血清中检测到交叉结合抗体反应（补充图2a, b）。  

使用基于VSV的假病毒中和实验46研究了针对NiV-B和HeV的交叉中和效力。NiV sG免疫在第二次免疫后（第42天）诱导了对NiV-B的交叉假病毒中和，第三次免疫后（第61天），1 μg和10 μg组的中和效力分别提高了约100倍和5倍（图3b）。相比之下，NiV G-ferritin小鼠血清在第二次免疫后（第42天）对NiV-B的交叉抑制活性比NiV sG组更强，分别提高了约133倍（1 μg组）和4倍（10 μg组），而第三次免疫后（第61天）仅观察到轻微的中和滴度增强（1 μg和10 μg组均<3倍）（图3b）。

 

接种疫苗的小鼠血清也能交叉中和HeV，尽管对NiV-B的交叉中和滴度远高于HeV（图3b, d）。此外，第三次免疫后对HeV的交叉中和抗体滴度高于前两次免疫的所有疫苗免疫组（图3d），表明增加免疫次数有助于提高对HeV的交叉中和能力。值得注意的是，NiV G-ferritin在第42天（第二次免疫后3周）诱导的HeV交叉中和抗体滴度比NiV sG高约3倍（1 μg组）和8倍（10 μg组）（图3d）。这些结果表明，将NiV G头域展示在铁蛋白纳米颗粒上增强了对HeV和NiV-B的交叉中和抗体反应。  

NiV G-ferritin诱导强效且持久的中和抗血清  

为了研究NiV G-ferritin的稳定性，我们还加入了商业含铝佐剂，并测试了NiV G-ferritin的储存和维持情况。我们制备了仅含NiV G-ferritin或与AddaVax（NiV G-ferritin-AddaVax）或铝佐剂（NiV G-ferritin-alum）混合的样品，并将其在4°C、27°C或37°C下储存不同时间点（从1小时到14天），通过SDS-PAGE、ELISA和生物层干涉仪（BLI）评估这些样品的稳定性。我们观察到SDS-PAGE上蛋白条带的大小和数量与在27°C下保存1小时或-80°C下的相关样品相似（补充图3a）。此外，所有测试样品在不同温度和储存时间下均表现出与抗NiV G单克隆抗体（HENV-26和nAH1.3）相当的结合信号（补充图3b-e），表明仅含NiV G-ferritin或与AddaVax或铝佐剂混合的样品在37°C下储存两周后仍保持稳定。  

鉴于铝佐剂的安全性，我们还检测了铝佐剂NiV G-ferritin（NiV G-ferritin-alum）的免疫原性，并评估了免疫小鼠的抗体反应（图4a）。与AddaVax佐剂NiV G-ferritin的结果一致，两剂免疫的NiV G-ferritin-alum显示出与三剂免疫相当的中和滴度，均表现出强效中和能力，NT50值>105.6（所有疫苗组在第60天）。假病毒中和实验表明，NiV G-ferritin-alum在所有测试条件下均诱导了相当的体液免疫反应（图4b-g）。  

 

为了评估NiV G-ferritin-alum的体液免疫反应持久性，我们在第三次免疫后约三周（第60天）、三个月（第132天）和六个月（第222天）收集了指定组的血清，并测量了假病毒中和抗体滴度。结果显示，所有免疫组小鼠的血清在第三次免疫后至少六个月内均保持了高水平的假病毒中和抗体滴度（NT50 > 105.2）（图4g），表明NiV G-ferritin-alum即使在37°C下储存两周后仍能诱导持久且强效的体液免疫反应。这些结果表明，NiV G-ferritin能够在室温下转移和储存至少两周而不影响其免疫原性。

正如预期，铁蛋白-alum未能诱导针对NiV-M的假病毒中和抗体。  

NiV G特异性中和单克隆抗体的分离与鉴定  

由于NiV G-ferritin能够诱导优异的体液免疫反应，我们还从免疫小鼠的脾脏或淋巴结中分离并鉴定了单克隆抗体（mAbs）。共产生了27种具有不同假病毒中和活性的抗NiV G单克隆抗体。最近的研究已鉴定出几种具有强效中和能力的抗NiV G单克隆抗体（HENV-32、HENV-26、nAH1.3、m102.3和m102.4），并在NiV G或HeV G蛋白上定义了其结合位点43,47,48。由于m102.3和m102.4与HENV-26结合位点重叠，我们纳入了HENV-32、HENV-26和nAH1.3，代表所有已报道的表位进行比较。重要的是，在27种mAbs中，24种mAbs比HENV-32更有效地抑制NiV-M假病毒感染，5种mAbs显示出比所有三种已发表抗体（HENV-32、HENV-26和nAH1.3）更高的中和活性（图5a）。  

 

为了确定这27种mAbs是否靶向NiV G头域表面的不同抗原区域，我们使用生物层干涉仪（BLI）进行了竞争结合实验。BLI实验表明，我们的mAbs可分为至少四个竞争结合组，其中组1和组2抗体（组1有3种mAbs，组2有1种mAbs）识别与已报道的三种mAbs不同的新抗原位点（图5b, c）。组3抗体包括7种mAbs，与人类mAb HENV-26竞争结合NiV G，后者靶向NiV G的受体（ephrinB2）结合位点；组4抗体包括16种mAbs，与小鼠mAb nAH1.3竞争，后者识别NiV G上远离受体结合位点的表位（图5b）。有趣的是，我们未分离到与HENV-32（组5）竞争结合G的mAbs，后者是一种人类mAb，其结合表位与HENV-26和nAH1.3不同。  

NiV G免疫原诱导的抗血清靶向四个不同的表位  

接下来，我们通过血清竞争ELISA实验研究了NiV sG和NiV G-ferritin免疫小鼠血清中的抗体组成。我们选择了五个竞争组的代表性mAbs（分别为S1E2、S2B10、LN3A12、LN3D3和HENV-32），并比较了这些mAbs在有无小鼠血清存在下与NiV G蛋白的结合信号。结果显示，NiV sG和NiV G-ferritin均能诱导与组1-4 mAbs竞争结合NiV G的抗体，而组5 mAb未观察到显著的血清阻断效应。这些结果表明，血清识别了NiV G头蛋白上的至少四个主要抗原位点，展示了NiV G抗原诱导的多克隆抗体反应的多样性（图6a）。对于组2和组4抗体竞争，NiV G-ferritin和NiV sG免疫小鼠血清显示出相当的效果。然而，对于组1和组3抗体竞争，NiV G-ferritin组显示出比NiV sG组更强的阻断活性，表明NiV G-ferritin可能诱导了更高浓度或更高结合亲和力的组1和组3抗体（图6a）。  

我们进一步定量评估了免疫小鼠血清中不同抗体的比例。在此实验中，首先将固定的G蛋白与过量不同组的mAbs、非G结合的同型对照mAb或无mAbs的封闭缓冲液孵育，然后监测免疫小鼠抗血清的结合信号。我们发现，识别受体结合位点的抗体在NiV sG或NiV G-ferritin免疫小鼠血清中对NiV G结合IgG的贡献最大（约50%）（图6b）。此外，在所有免疫小鼠血清中均未检测到组5抗体（图6b），这与血清竞争结果一致（图6a）。  

 

NiV G-ferritin完全保护叙利亚金黄仓鼠免受致死性NiV-M攻击  

我们随后采用叙利亚金黄仓鼠模型，以探究NiVG-ferritin所诱导的免疫反应是否对同源NiV-M攻击具有保护活性。鉴于六周龄仓鼠的体重较六周龄小鼠高出约五倍，我们首先在仓鼠疫苗接种研究中使用了双倍剂量的抗原。仓鼠分别接种不同剂量的NiVG-ferritin和NiV sG（2、6及20 μg/剂，n = 3），随后检测其血清对NiV-M假病毒的中和抗体滴度（补充图4）。首次（第21天）及二次（第39天）免疫后，观察到接种NiV G-ferritin的仓鼠体内中和抗体滴度，并发现2 μg组与较高剂量组（6 μg/剂及20 μg/剂）中和活性相当（补充图4c、d）。此外，首次免疫后，所有测试剂量下接种NiV sG的仓鼠体内NiV-M假病毒中和滴度均低于检测限，二次免疫后仅在NiV sG组观察到不同程度的中和活性。二次免疫三周后，接种仓鼠接受致死性NiV-M感染挑战，所有接种NiV G-ferritin的仓鼠均免于死亡且无体重减轻（补充图4e、f）。相比之下，接种20 μg/剂NiV sG的一只仓鼠在NiV-M挑战后第6天死亡。

鉴于2 μg/剂NiV G-ferritin在仓鼠中诱导出对NiV-M攻击的保护活性，而两剂NiV sG可能无法提供100%保护，我们进一步探究了三剂免疫方案下NiV sG与NiV G-ferritin的保护效力。仓鼠分别接种三剂2 μg/剂NiV sG、等摩尔NiV G-ferritin或ferritin，并于每次接种后三周采集血清（图7a）。假病毒中和实验结果显示，首次免疫后，NiV G-ferritin迅速诱导出可检测的NiV-M假病毒中和滴度（几何平均NT50，1:1204）（图7b）。相比之下，二次免疫后，NiV sG在仓鼠中诱导的假病毒中和滴度相对较弱（NT50，1:584）（图7b）。随着第二、三次免疫的推进，NiV G-ferritin与NiV sG诱导的仓鼠血清假病毒中和滴度均有所提升（第二、三次免疫间NT50值变化倍数：NiV G-ferritin组4.2倍，NiV sG组14.4倍）。一致地，第三次免疫后，NiV G-ferritin免疫仓鼠血清对两种真实NiV病毒的中和效力较NiV sG组提升约2倍，而单独接种ferritin的仓鼠血清中未检测到中和抗体（图7c）。这些结果与小鼠体液免疫结果一致，尽管仓鼠血清的中和效力显著弱于小鼠血清（图2）。

第三次免疫三周后，所有实验仓鼠腹腔注射致死剂量NiV-M（1000 LD50）（图7a）。挑战后21天监测存活率（每组n = 6）。所有疫苗免疫仓鼠在21天观察期内均存活且无明显体重减轻。所有接种ferritin的对照动物在NiV-M挑战后6天内死亡（图7e、f）。每组六只仓鼠在病毒感染后第5天实施安乐死，采集肺、脑及脾脏进行病毒载量检测。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定病毒滴度。ferritin对照组安乐死仓鼠的肺（均值：~109.7拷贝/g）、脑（均值：~107.9拷贝/g）及脾脏（均值：~109.4拷贝/g）中检测到高水平NiV RNA，而疫苗组中未检测到NiV RNA（图7g），表明三剂NiV G-ferritin与NiV sG完全抑制了肺、脑及脾脏中的病毒复制，并保护仓鼠免受致死性NiV攻击。

 

讨论

G-铁蛋白表现出更强的稳定性和效力。尽管某些纳米颗粒疫苗也能引发细胞免疫反应37,52，但在接种NiV G-铁蛋白或NiV sG的小鼠中，我们并未观察到细胞免疫反应。这可能是由于实验中使用的不同抗原、纳米颗粒支架、免疫剂量或动物模型所致。与我们的NiV G-铁蛋白类似，多种纳米颗粒疫苗也主要诱导体液免疫反应，如针对拉沙病毒53、SARS-CoV-254、流感病毒35、呼吸道合胞病毒55和波瓦桑病毒56的纳米颗粒疫苗。

尽管体液反应存在差异，但三次接种NiV G-铁蛋白和NiV sG完全保护了仓鼠免受致死性NiV攻击，且在免疫动物组织中未检测到病毒RNA。此外，两剂NiV G-铁蛋白也完全保护了仓鼠免受致死性NiV-M攻击，并观察到持续的体重增加（补充图4），但接种20 μg/剂NiV sG的三只仓鼠中有一只死于NiV感染（补充图4e）。这些结果表明，在三剂或两剂免疫方案中，NiV G-铁蛋白的保护效力似乎与NiV sG相当，甚至在某些情况下更优。由于单剂NiV G-铁蛋白免疫在小鼠和仓鼠中均引发了强效的假病毒中和抗体，我们推测单剂疫苗接种也可能在动物中提供对致死性NiV攻击的保护，尽管这需要进一步研究。

此外，仓鼠在免疫期间未出现体重减轻（图7d和补充图4b）或明显的不良事件，表明安全性可能无需担忧。我们还评估了NiV G-铁蛋白在不同储存温度下的蛋白质稳定性和免疫原性，发现NiV G-铁蛋白在至少两周内保持稳定，甚至在高于标准室温的温度下也是如此。这减少了对冷链运输的需求，这是其他疫苗所面临的挑战。值得注意的是，我们的纳米颗粒疫苗是通过将NiV G头部结构域与铁蛋白基因融合并使用真核表达系统表达而生成的，这消除了蛋白质纯化和体外组装抗原与纳米颗粒支架的单独步骤，极大地提高了疫苗安全性并简化了生产流程。

最近的研究表明，分离的中和单克隆抗体（mAbs）可以在体内提供对NiV感染的保护。NiV G-铁蛋白表现出优异的免疫原性，并具有针对NiV-B和HeV的强效交叉中和活性，促使我们从NiV G-铁蛋白免疫的小鼠中分离mAbs。鉴定出一组27个mAbs，这些mAbs识别NiV G蛋白上的非重叠抗原位点。作为一种具有高致死率的再发人畜共患病毒，NiV具有引发人类重大流行病的潜力49。尽管多种NiV候选疫苗已在临床前和临床阶段进行了测试，但目前尚无FDA批准的NiV疫苗或有效治疗方法4。因此，开发更多安全、有效且低成本的NiV疫苗仍然至关重要。先前的研究表明，NiV G蛋白是疫苗开发的关键抗原23–25，尤其是G蛋白的头部结构域，其在免疫优势上优于G蛋白的胞外域47。

在此，我们设计了一种基于NiV G头部结构域的纳米颗粒免疫原，并全面表征了小鼠和仓鼠中的免疫反应。此外，我们分离了一组具有不同中和活性的mAbs，这些mAbs识别NiV G蛋白上的四个不同抗原位点。尽管亚单位疫苗被认为是各种疫苗平台中最安全的，但传统的重组亚单位疫苗存在明显的缺点50,51。与传统的亚单位疫苗相比，自组装纳米颗粒疫苗具有与病毒样颗粒（VLPs）相似的特征，并可能在体内引发更强的免疫反应，这可能是由于（1）重复的抗原结构赋予纳米颗粒与低亲和力B细胞的高亲和力结合；（2）纳米颗粒的较大尺寸改变了抗原的运输、积累和免疫细胞及系统的处理。尽管可溶性NiV sG能在小鼠和仓鼠中诱导中和抗血清，但NiV G-铁蛋白引发的结合和中和效价更高。它们还表现出对NiV假病毒感染的强效体外中和活性，为未来的mAb鸡尾酒治疗提供了极佳的机会。总之，我们成功设计了一种以NiV G蛋白头部结构域为抗原靶点、铁蛋白为抗原展示平台的NiV G纳米颗粒疫苗候选物。我们发现，NiV G头部结构域是NiV疫苗开发的典范抗原靶点。此外，分离出针对NiV感染的潜在治疗性抗体，为mAb生成和免疫原性评估提供了有吸引力的途径和策略。鉴于NiV G-铁蛋白在小鼠和仓鼠中引发了强效且具有保护性的体液免疫，值得进一步评估。

 

方法

北伦理声明

动物实验已获得武汉大学动物伦理委员会（WDSKY0202201）和中国科学院武汉病毒研究所（WIVAF21202301）的批准。这在动物生物安全四级（ABSL-4）实验室（位于中国科学院武汉国家生物安全实验室）进行了真实的病毒感染实验。

病毒和细胞

用于真实病毒中和试验和攻毒研究的尼帕病毒马来西亚株（AF212302.2）和尼帕病毒孟加拉株（AY988601.1）是从中国科学院武汉病毒研究所国家病毒资源中心获得的。所有真实病毒均在 Vero E6 细胞中培养。Vero E6 或 293 T 细胞在含 8%或 10%热灭活胎牛血清（ExCell Bio）的 DMEM（Monad Biotech）中培养，培养条件为 37°C、5%二氧化碳。

克隆、蛋白质表达和纯化

尼帕病毒马来西亚株（NiV-M）的 G（NP_112027.1）和 F（NP_112026.1）、尼帕病毒孟加拉株（NiV-B）的 G（AAY43916.1）和 F（AAY43915.1）、亨德拉病毒（HeV）的 G（NP_047112.2）和 F（NP_047111.2）、莫焦病毒（MojV）的 G（YP_009094095.1）、莱索托病毒（LayV）的 G（UUV47206.1）、幽门螺杆菌铁蛋白（WP_000949190.1）和牛蛙铁蛋白片段（ESQVRQQF）的基因经过密码子优化，并由清科生物技术有限公司合成。编码尼帕病毒马来西亚株、尼帕病毒孟加拉株和亨德拉病毒全长 G 和 F 的基因分别被克隆到哺乳动物表达载体中，用于假病毒的生成。编码幽门螺杆菌-牛蛙杂交铁蛋白的基因是按照先前描述的方法构建的 38 ，并被克隆到一个哺乳动物表达载体中，该载体带有 N 端 6×His 标签，且无信号肽用于蛋白质生产。编码尼帕病毒 G 铁蛋白的基因是通过将尼帕病毒 G 头部结构域的 C 端与之融合构建而成的。

负染电子显微镜

纯化的纳米颗粒被依次稀释至 800/400/200/100/50 nM，然后取 10 μL 样品吸附于 300 目铜网（北京大吉凯易科技有限公司，D11023）上 1 分钟。接着，用滤纸吸去多余的溶液。将铜网用 2%醋酸铀染色 30 秒，再吸去多余的溶液。使用透射电子显微镜（日本电子株式会社，JEM-1400plus）或 Talos L120C（赛默飞世尔科技）电子显微镜收集图像。

动态光散射（DLS）

蛋白质通过 0.22 μm 滤器过滤，并用含 20mM Tris-HCl（pH 8.0）和 150mM NaCl 的缓冲液稀释至约 0.5mg/mL。然后，将样品装入微量比色皿中，使用 Zetasizer Nano ZSP 仪器（马尔文帕纳科）测量水动力直径和多分散性。每个样品进行三次重复测量，每次平行重复持续 60 秒，温度为 25°C。使用仪器软件（马尔文帕纳科）分析样品的水动力直径和多分散性指数。

差示扫描荧光法（DSF）

使用 PSA-16 型仪器（北京佰司特科技有限责任公司）测定目标蛋白的热稳定性。将样品稀释至 0.5 毫克/毫升，取 20 微升稀释后的样品装入石英玻璃管（货号：LG-002，京佰司特科技有限责任公司）。这在 23 至 97°C 的线性温度扫描过程中，以 1°C/分钟的升温速率测量了 330 和 350 纳米处固有蛋白质荧光强度。根据 F350/F330 曲线的斜率计算出热变性中点温度（Tm）。每个样品测量四次。

尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC-MALS）

将每份样品（NiV G-铁蛋白为 0.5 毫克/毫升，NiV sG 为 2 毫克/毫升）的 100 微升注入 WTC-030S5 柱（Wyatt Technology，加利福尼亚州圣巴巴拉，美国），以 0.5 毫升/分钟的恒定流速运行 40 分钟。使用 20 毫摩尔 Tris-HCl（pH 8.0）和 150 毫摩尔 NaCl 作为流动相。将 MALS 检测器（DAWN®）和折射率（RI）检测器（Wyatt Technology，加利福尼亚州圣巴巴拉，美国）串联连接到 SEC 系统的紫外检测器上。使用牛血清白蛋白（BSA，Thermo Scientific）对静态光散射检测器进行校准。使用 ASTRA 软件（6.1.2.84 版）（Wyatt Technology，加利福尼亚州圣巴巴拉，美国）分析光散射、差示折射率（dRI）测量值和分子量。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定了尼帕病毒（NiV）G-铁蛋白的抗原性。简而言之，将 96 孔 ELISA 板（康宁）在 4°C 下过夜包被 3 μg/mL 的 NiV sG 或 NiV G-铁蛋白，包被缓冲液为 0.1M 碳酸盐缓冲液（pH9.6）。用 PBS-T（含 0.05%吐温 20 的 PBS）洗涤四次后，所有孔用 50 μL 封闭缓冲液（1% BSA 在 PBS-T 中）在 37°C 下封闭 2 小时。封闭后，将 NiV G 单克隆抗体 HENV-32、HENV-26、nAH1.3 和抗狂犬病毒单克隆抗体 RVC20（作为阴性对照）从 5 μg/mL 开始进行系列稀释，然后加入板中，在 37°C 下孵育 2 小时。用 PBS-T 冲洗四次后，加入 1∶20000 稀释的 HRP 标记的山羊抗人 IgG（ABclonal，AS002）在 37°C 下孵育 1 小时。再次冲洗板，每孔加入 50 μL 一液 TMB 显色液（NCMBiotech），在 37°C 下显色 10 至 30 分钟。用 50 μL 1M 盐酸终止显色反应，然后在 450 nm 处测量吸光度（OD450）。对于血清结合滴度检测，我们进行了类似的程序，将 NiV-M、NiV-B、HeV、LayV 和 MojV 的 G 头蛋白包被在 ELISA 板上，并使用 1∶8000 稀释的 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（ABclonal，AS003）。

动物实验 - BALB/c 小鼠

BALB/c 小鼠（6 - 8 周龄，雌性）购自维通利华实验动物技术有限公司（北京，中国）。在疫苗免疫原性评估实验中，将 BALB/c 小鼠随机分为六组，每组六只。小鼠分别接种 1 微克或 10 微克的尼帕病毒 sG 蛋白或相应量的含等摩尔比尼帕病毒 sG 的尼帕病毒 G-铁蛋白。对照组小鼠则接种 PBS 或等摩尔量（与 10 微克尼帕病毒 sG 相当）的铁蛋白。所有小鼠均通过肌肉注射（i.m.）途径接种三次，每次接种均加入 AddaVax 佐剂（InvivoGen），接种间隔为三周。在首次免疫后的不同时间点（第 7、14、21、42 和 61 天）采集血清，以检测体液免疫反应。在第 61 天，小鼠在 2%异氟烷麻醉后通过颈椎脱臼法处死，收集脾细胞和淋巴结细胞，用于细胞免疫反应分析和抗原特异性 B 细胞分选。对于温度稳定性实验，将 BALB/c 小鼠随机分为九组，每组五只。尼帕病毒通过将尼帕病毒（NiV）G-铁蛋白与 Imject Alum 佐剂（赛默飞世尔科技）混合制备了 G-铁蛋白疫苗。随后，将制备好的 NiV G-铁蛋白-铝佐剂疫苗分别在 4°C、27°C 和 37°C 下保存 7 天或 14 天。在 27°C 下保存 1 小时的 NiV G-铁蛋白-铝佐剂疫苗样本作为阳性对照，而用 PBS 或等摩尔铁蛋白免疫的小鼠作为阴性对照。所有小鼠均通过肌肉注射途径接种三次，间隔三周。在预定时间采集血清以检测体液免疫反应。

动物实验 - 叙利亚仓鼠

从北京维通利华实验动物技术有限公司购买六周龄雌性叙利亚仓鼠，随机分为三组，每组 12 只。将 2 微克的 NiV sG、NiV G-铁蛋白（含等量 2 微克的 NiV G 抗原）或等摩尔铁蛋白与 50%（体积比）的 AddaVax 佐剂（InvivoGen）混合。然后，这些免疫原每隔三周肌肉注射给仓鼠三次。在指定时间点采集血清样本并进行免疫学检测。三次在最后一次免疫接种数周后，所有动物均被转移至生物安全四级实验室（ABSL-4），每只仓鼠均通过腹腔注射方式接受 1000 个半数致死量（LD50）的尼帕病毒（NiV-M）攻击。在接种疫苗前以及眼眶后部采血和病毒接种时，仓鼠均用 5%异氟烷麻醉。每组动物中的一半在接种尼帕病毒五天后在异氟烷麻醉下通过颈椎脱臼法安乐死，然后采集肺、脑和脾脏等器官，通过实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测病毒载量。每组动物中的另一半在攻击后监测 21 天，监测结束时计算存活率。

 

蛋白稳定性分析仪PSA-16

北京佰司特科技有限责任公司于2023年推出了自主研发的第一款国产的蛋白稳定性分析仪PSA-16。

PSA-16的性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性研究分析领域的空白。

主要参数★ 测定参数：Tm、Cm、ΔG等；

★ 样品通量：16个；

★ 样品体积：≤20 uL；

★ 浓度范围：0.01-200 mg/ml；

★ 温控范围：15-110度；

★ 变温速度：0.1-15度/分钟；

★ Tm重复性：CV小于1%；

★ 耗材参数：一次性，无需清洗；

★ 八联排设计，适配多通道移液器；

 

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。

PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。

 

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。

1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选

2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等

3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗体偶联药物（ADC）研究

5.    多结构域去折叠特性研究

6.    物理和化学条件强制降解研究

7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）

8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白纯化条件快速优化等

 

 

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)

类器官串联芯片培养仪—HUMIMIC；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪—IMOLA；光片显微镜—LSM-200；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子质量光度系统—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

电荷光度测量系统—illumionONE；全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；台式原子力显微镜—ACST-AFM；微纳加工点印仪—NLP2000DPN5000；