应用案例(便携式4通道SPR仪-P4SPR):SPR传感芯片的功能化,用于生物分子相互作用研究

SPR传感芯片的功能化,用于生物分子相互作用研究

SPR sensor surface functionalization for biomolecular interaction investigation with P4SPR 

翻译整理:北京佰司特贸易有限责任公司

背景介绍

SPR用于生物分子结合的研究

P4SPR基于表面等离振子共振(SPR)现象,可实时研究表面捕获分子(Capture molecule) 与目标分子(Target molecule)之间的无标记相互作用。利用适当的偶联方法,捕获分子首先固定在SPR传感器芯片的表面,并使目标分子溶液流过该表面(图1)。捕获分子和与目标分子的分子量范围涵盖从小到大的各种生物分子,例如核酸(DNA)和多肽(蛋白质)。捕获分子与其目标分子的结合可产生特定的SPR信号,该信号转化为传感器表面的折射率变化现象。

图1. 生物传感器的关键要素

图2。 通过生物分子识别使SPR传感器功能化的步骤

 

SPR传感器芯片功能概述

根据捕获分子的种类(识别的化学元素),有多种策略可以使SPR芯片传感器功能化。除了抗体和多肽是SPR中最普遍的捕获分子,还有其他生物分子(例如DNA / RNA,脂质和碳水化合物)的生物传感器也可以使用。在这里,我们以蛋白质作来举例说明如何偶联芯片表面。偶联蛋白质功能化芯片传感器主要策略可以分为三个步骤:裸金表面,表面化学修饰和偶联(图2)。第一步通常需要纯度高的一层金属表面(例如金膜)。然后,通常使用Au-S键将2D层(例如自组装单分子层(SAM))或3D层(例如葡聚糖或PEG)包被在传感器表面上。最后,捕获分子(例如抗原)通过共价结合(例如EDC / NHS结合)或通过强结合(例如Ni-NTA和链霉亲和素/生物素)偶联到表面化学修饰上。

表面功能化的重要性

在设计SPR实验时,选择正确的表面化学物质是正确固定捕获分子,保持高活性并获得特定研究的生物分子相互作用的SPR数据的关键。

 

图3.  ELISA与SPR中功能化步骤的差异

将SPR传感器的功能与ELISA进行比较(图3)时, ELISA和SPR涉及一种分层方法,该方法包括将捕获分子锚定在传感器或孔壁上并捕获目标分子。在ELISA中,捕获分子是抗体,抗体包被步骤是被动过程,因为抗体吸附到孔壁上。但是,在SPR中,固定捕获分子(抗体,肽,DNA,酶等)是一个主动的过程,需要仔细选择连接臂,活化试剂和固定条件(例如缓冲液,时间,pH)。 SPR传感器功能化可以允许在此过程中发挥更多的策略选择,并优化与目标分子的相互作用。

表面化学在SPR中的作用

表面功能化本质上是用自组装单分子层(SAM)或连接分子化学包被表面以进一步促进捕获分子固定化的过程。表面化学作用对于确保捕获物和目标分子在表面处相互作用的特异性至关重要。先前已经探索了用于使传感器表面功能化的多种化学方法(例如SAM,水凝胶和PEG)用于SPR分析

捕获分子的后续耦合或固定化可以通过捕获分子与SAM或连接分子的共价或非共价相互结合,后续评估目标分子与捕获分子的结合。在开发或优化SPR分析时,功能化的传感器芯片起着至关重要的作用,因为选择合适的表面化学物质以及固定条件将有助于数据质量。这是由于以下事实:捕获分子在表面上的数量和活性将影响结合反应以及方法的灵敏度。因此,高质量和低成本的传感器芯片将是最有佳的。

本技术说明的目的是提供有关SPR传感器芯片设计的背景知识,并讨论传感器芯片表面功能化和偶联方法对于各种应用中SPR分析的重要性。

P4SPR传感器芯片的设计

P4SPR系统使用的传感器芯片由玻璃棱镜制成,该棱镜上涂有一层薄薄的金。当传感器芯片插入P4SPR腔中,最佳条件的SPR信号而生成,如图4所示。然后可以使用固定各种捕获分子的不同表面化学方法来修饰传感器表面。

图4 –P4SPR 金面传感器在打开(左侧)和关闭(右侧)设备中。

传感器芯片具有3个基本功能:

玻璃芯片:从外观上看,玻璃芯片是根据微型鸽子棱镜设计,其较长的边缘可用于光路,而较短的边缘则便于操作传感器芯片。如果用户希望准备自己的金属表面用于等离子材料研究,纳米或微图案化表面,其他金属成分以及表面材料研究,则可以使用未包被的玻璃芯片。

金属薄膜:金属薄膜的薄层是通过金属沉积蒸发过程生成的,这确保了传感器芯片在不同批次之间的可重复性。每批次都可以提供薄层厚度的鉴定证书,以确保所制造的芯片具有最高的质量。还可以定制其他组成,厚度或图案的金属薄膜。

Au(金面)传感器+表面功能化:特异性取决于表面上连接分子的化学性质。Affinité Instruments技术可确保一致的表面涂层,并具有最少的非特异性相互作用,这些非特异性相互作用是由捕获分子的定向错误以及基于(LSPR)纳米颗粒的表面经常出现的针孔缺陷引起的。下面提供了每种Au传感器的更多详细信息,以及一些实验需求的示例,可以通过选择多种Affinité Instruments的传感器芯片来满足这些需求(表1)。

表1 – P4SPR传感器的应用建议

金传感器

推荐用于

Au sensors + metal ion-NTA

重组蛋白的螯合

Au sensors + Affinicoat

复杂基质(血清,细胞裂解液)中的共价偶联和分析

Au sensors + 16-MHA

共价偶联和亲水性(蛋白质,DNA / RNA)和疏水性捕获分子(脂质和膜相关分子)

Au sensors + streptavidin

生物素化的捕获分子(DNA,寡聚物,适体,蛋白质,碳水化合物和脂质)的非共价高亲和力结合

Au sensors

硫醇化捕获分子(DNA / RNA,蛋白质)和新型SAM材料,生物污染分子,分子印迹聚合物

 

各种金传感器的表面功能

*下面列出的所有表面化学成分均由Affinité提供

Au sensors + Metal ion-NTA

这种类型的传感器具有连接分子,该连接分子与螯合至金属离子(Co2+ 或Ni2+)的次氮基三乙酸(NTA)偶联,提供了附着聚组氨酸标签的(His-tag)蛋白的手段,以捕获目标分子。这通常用于涉及重组蛋白的应用。可以用EDTA再生表面,EDTA去除金属离子以释放螯合的蛋白质。与共价偶联相比,这种方法对His-tag蛋白而言既简单又方便,因为与共价偶联相比,共价偶联需要更多步骤才能将捕获分子固定在传感器表面上。

Au sensors + Affinicoat TM

Affinité Instruments专有的肽修饰的Afficoat TM传感器表面大大减少了非特异性相互作用,并保持了固定化生物分子的活性或功能。考虑到生物样品的复杂性,非特异性相互作用尤为重要。 Afficoat TM是具有高亲水性的两性离子肽,先前已证明对非特异性吸附具有抵抗力。在Afficoat TM中发现的α-螺旋构象被证明可以将不需要的生物污垢从表面驱走。通过最大限度地减少非特异性相互作用,Afficoat TM可以为分析提供更高的灵敏度和较低的背景杂音。

Au-sensors + 16-MHA

包被的Au传感器具有疏水性和不带电荷的表面,该表面由直接连接到金膜上的长链烷硫醇分子组成。这提供了更疏水的表面,其可用于减少高电荷生物分子的非特异性相互作用。该传感器芯片还设计用于处理脂质和膜相关分子。

Au-sensors + Streptavidin

涂有链霉亲和素的Au传感器的表面带有链霉亲和素已经共价连接的连接分子。链霉亲和素是一种对生物素具有高亲和力的四聚体蛋白(解离平衡常数KD≈10-15 M),因此可以为生物素化目标分子的高亲和力非共价结合做好准备。生物素与链霉亲和素的相互作用是如此强,以至于生物素化的捕获分子通常不能被去除以再生链霉亲和素表面。这为难以共价固定的捕获分子提供了另一种选择。

Au sensors

可以使用静电力或含金和硫醇的蛋白质,DNARNA的形成,利用自组装的单分子层和生物分子对

裸金表面进行功能化处理。这也使用户可以灵活地研究自己的表面化学性质。

常见的偶联方法

选择适当的偶联方法可以允许捕获分子在表面上固定和保留活性。在实验过程中,捕获分子通过不同的偶联程序固定在功能化的传感器芯片上,具体取决于捕获分子的特性。表2列出了不同类型的捕获分子和偶联方法。开发偶联方法可能需要研究几种方法,例如直接共价偶联,His-标签螯合和链霉亲和素-生物素结合(图5)。主要目的是使活性形式的捕获分子具有相当大的表面密度,以便与目标分子进一步结合相互作用。

最常见的第一个耦合步骤是捕获分子与连接臂分子的直接共价偶联。捕获分子使用EDC / NHS化学方法直接偶联,与硫醇化的连接分子形成共价酰胺键。共价键是在SPR运行期间形成的,需要几个步骤来准备连接分子,使其在捕获分子流过时共价偶联。其次,硫醇化的连接分子与亚硝酸盐酸结合到金属离子上形成共价键。然后将组氨酸标签的蛋白质螯合到金属离子上。在这种情况下,不需要其他步骤。一旦His-tag蛋白溶液流过传感器表面,就会发生这种耦合。最后,硫醇化的连接分子与链霉亲和素化学连接。与His-tag蛋白螯合相似,一旦溶液流过表面,生物素化的捕获分子就会与链霉亲和素结合。

5 偶联方法a)共价偶联bHis-标签螯合c)链霉亲和素-生物素结合。

 

互动研究的示例

表面涂层的不同选择已用于SPR分析中的生物分子相互作用的研究。表3提供了以前使用SPR技术研究的交互作用的示例。Affnité Instruments提供可靠且高质量的传感器,以更好地表征这些相互作用。除了用于研究生物分子相互作用的应用之外,丰富的传感器种类还可允许灵活地适应其他应用领域的用途,例如测定方法开发,临床分析以及环境和材料科学。

结论

此技术说明中介绍了用于SPR分析的表面功能化以及不同类型的P4PSR传感器。功能化的P4SPR传感器的变化(即表面化学)将决定分析性能,并且可以针对感兴趣的应用进行优化设计。还已经描述了偶联方法以适应多种捕获分子的固定化。

公司简介

Affinité Instruments成立于2015年,是一个从蒙特利尔大学衍生的企业。Affinité Instruments的创始人在SPR领域积累了十多年丰富的研究结果的知识,并通过多元化的商业、科学和工程领域经验将创新的SPR技术商业化。

表2 –各种捕获分子的建议偶联方法

 

耦合方式

Capture molecules/biomolecules

直接耦合

His-tag标签螯合

链霉亲和素-生物素结合

抗体

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抗原

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抗体片段

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其他蛋白质

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多肽

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小分子

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DNA/RNA

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寡核苷酸

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适配体

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碳水化合物

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纳米粒子

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表3 –生物分子相互作用的总结

 

Target Molecules

 

Capture molecules

抗体

抗原

抗体片段

其他蛋白质

小分子

DNA/RNA

寡核苷酸

适体

碳水化合物

细胞

抗体

 

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抗原

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抗体片段

 

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其他蛋白质

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小分子

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DNA/RNA

     

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寡核苷酸

             

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适体

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碳水化合物

     

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细胞

     

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纳米粒子

 

 

 

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Affinité的P4SPR设备的简单、低成本且易于操作等特点降低了SPR应用的难度,紧凑的P4SPR,其外形尺寸与一个A4书本相当,可以在实验室工作台上很容易地设置,并在几分钟的培训中由任何人 (从本科生到宇航员,高级化学家到周末科学家)操作。P4SPR 的坚固设计提供了从几分钟到几个小时的独特的灵活测定时间,以适应广泛的生物分子相互作用动力学。便携式4通道SPR仪-P4SPR是基于SPR原理,可实现实时无标记检测相互作用,不仅可以满足传统的大型SPR设备的参数要求,还可以用于户外现场中的农药残留、微量药物、污染物、爆炸物等环境试验。可以用于验证结合、亲和力测定、动力学测定、浓度测量;适用于小分子化合物(<100Da的小分子)、核酸、多肽、蛋白、脂类、多糖、纳米颗粒、病毒、微生物、细胞等各种样品;可检测各种复杂样品,如血液、牛奶等;4通道同时检测,实时扣除背景,自动做重复,获得可信数据;10分钟验证是否结合,并且获得亲和力和结合/解离速率;可手动进样,操作简单,无需专人操作和维护;可与其它仪器(HPLC,MS等)联合使用。


主要参数:

※ 基于SPR原理,实时无标记检测相互作用

※ 可以用于验证结合、亲和力测定、动力学测定、浓度测量

※ 适用于小分子化合物、核酸、多肽、蛋白、脂类、多糖、纳米颗粒、病毒、微生物、细胞等各种样品

※ 可检测各种复杂样品,如血液、牛奶等

※ 4通道同时检测,实时扣除背景,自动做重复,获得可信数据

※ 10分钟验证是否结合,并且获得亲和力和结合/解离速率

※ 可手动进样,操作简单,无需专人操作和维护

※ 可与其它仪器(HPLC,MS等)联合使用

※ 仪器小巧,易于携带,可在用于各种户外环境中的现场检测

※ 价格合适,单个实验室即可负担,方便日常使用

 

北京佰司特贸易有限责任公司 (https://www.best-sciences.com):

类器官培养仪-HUMIMIC;灌流式细胞代谢分析仪-IMOLA;便携式4通道SPR仪-P4SPR;蓝光/绿光LED凝胶成像;Nanocellect细胞分选仪-WOLF;微纳加工点印仪-NLP2000/DPN5000;

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创建时间:2020-12-31 16:07